恙虫病诊断技术及其新进展

检验医师

恙虫病(Scrub typhus)又名丛林斑疹伤寒，是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushf，Ot)感染所致的一种发热性自然疫源性疾病。Ot的主要动物宿主为鼠类，经恙螨幼虫叮咬而传播。

恙虫病主要分布于亚太地区的热带和亚热带，尤以东南亚、澳大利亚和远东地区常见，近年来逐渐向温带地区蔓延。全世界每年至少有10亿人有发病风险，约有100万病例发生。

抗菌药物可有效治疗该病，但因延迟诊断、贻误治疗导至的病死率在7．8%～25．0%。近年来，恙虫病在许多国家或地区再燃，发现多种新基因型Ot，并发现抗菌药物耐药现象。

在我国，恙虫病主要分布在东南沿海地区，1986年以后长江以北地区频繁出现恙虫病的暴发或流行；2013年广州番禺和东莞地区均有恙虫病死亡病例报道。

目前，恙虫病疫苗研制虽有所进展，但仍未成功。恙虫病在我国尚不属法定传染病，由于医务人员对该病认识不足和诊断技术的限制等原因，该病的漏诊、误诊率较高，其流行强度被严重低估。

提高恙虫病的早期诊断率，对改善患者预后、减轻疾病负担具有重要意义。现就恙虫病诊断技术及其研究进展予以介绍。

一、临床表现

临床表现结合流行病学史是诊断恙虫病最直接和常用的方法。该病的临床表现不典型，有高热、局部淋巴结肿大、皮疹、肝脏和脾脏肿大或多器官损伤等，与其他急性发热性疾病，如鼠型斑疹伤寒、细螺旋体病和登革热等非常相似，易发生误诊，延误治疗，导至并发症，甚至死亡。

皮肤特征性焦痂或溃疡常作为临床诊断恙虫病的重要依据，焦痂常发生于腋下、腹股沟、会阴等隐蔽部位，且多无痛痒感，常发生漏检。焦痂的发生率有地区差异，从7%～100%不等，并可能与感染Ot型别有关。

因此，仅以特征性焦痂或溃疡作为该病诊断依据可能会导至相当多的漏诊。临床表现可为临床医师提供诊断线索，但明确诊断尚需辅以实验室检查，以缩短病程、获得良好的治疗结局。

二、血清学诊断方法

目前血清学检测仍是最主要的恙虫病实验诊断方法，通过检测血液中的Ot抗原或抗体作出诊断。以往由于以传代培养来纯化制备抗原，过程繁琐，在一定程度上限制了此类方法的应用。随着分子生物学技术不断发展，重组抗原的产生和单克隆杂交瘤技术的出现，促进了传统血清学技术的发展。

1．外斐反应(weil—Felix test，WFT)：

变形杆菌属OXk株与Ot存在交叉免疫原性，因此以OXk抗原与患者血清进行交叉凝集反应，可检测患者血清中Ot抗体，辅助诊断恙虫病。

wFT是我国医疗机构应用最广泛的恙虫病实验室诊断技术，现行的判断标准是变形杆菌OXk抗原凝集效价≥1：160为阳性。

Kularatne和Gawarammana发现，以凝集效价1：320为界诊断急性立克次体病，灵敏度为33%，且54%健康志愿者和62%非立克次体发热患者为阳性。

于乐成等以抗体效价≥1：80为阳性标准诊断恙虫病，wFT灵敏度为44．4%，特异度为94．1%。因许多发热患者血清存在交叉反应，wFT易产生假阳性，而早期抗菌药物的使用也使wFT易出现假阴性，故wFT的灵敏度和特异度均较低。但wFT价格低廉，操作简单，无需特殊的仪器设备，亦可通过检测恢复期血清提高灵敏度，故在基层医疗卫生机构中常用。

2．免疫荧光技术(immunofluorescence technique，IF)：

免疫荧光实验分为间接法和直接法，其中间接法最常用。1963年Bozeman和Elisberg将间接免疫荧光实验(indirectimmunofluorescence assay，IFA)用于恙虫病的诊断，该技术一直被认为是诊断恙虫病的金标准。

以IFA检测双份血清，抗体效价呈4倍及以上升高即可确诊，具有较高的灵敏度和特异度。由于此法属于回顾性诊断，难以达到指导临床治疗的目的。若以单份血清诊断，其诊断界值必须以基于当地流行病学研究的效价作为标准比。

Ot抗原型别多样。现已在至少9个国家(地区)发现30种抗原性不同的Ot原型株，不同地域Ot基因型、表型分布差异很大。例如，韩国主要的Ot基因型是Boryong和Kawasaki型，而我国山东地区Ot主要基因型别是与日本Kawasaki型相似的Sdu-1型。

长期以来，以Karp、Kato和Gilliam 3种血清型为抗原，以通用的IFA抗原进行血清学检测易出现假阴性，造成漏诊。这就要求不同地区应以当地流行株型别作为检测抗原进行IFA测定，以减少漏诊的发生。

此外，不同地区应予针对性的流行病学调查，以确定人群对Ot的正常免疫(IgM和IgG)水平，作为判定IFA阳性的抗体效价依据。IFA需要免疫荧光显微镜和训练有素的专业人员，故很难在农村、基层单位和调查现场使用。

但相对WFT，IFA的特异性强、灵敏性高，可用于早期恙虫病诊断，故值得在有条件的医疗机构推广使用。

3．补体结合试验(complement fixation test，CF)：

CF试验检测Ot特异性抗体，常用当地的代表株抗原或多价抗原进行检测，CF也可用于鉴定型别，有较好的特异度和灵敏度，但受抗原制备、操作复杂等诸多因素的影响，很难推广使用，不建议临床诊断使用。

4．免疫酶染色法(immunoperoxidase assay，IP)：

IP分为直接法和间接法，基本原理与免疫荧光技术相似，不同的是使用酶染料代替荧光染料。间接免疫酶染色法(indirectimmunoperoxidase assay，IIP)不需要荧光显微镜，用普通显微镜即可观察；它具有良好的可重复性，较高的灵敏度和特异度，在恙虫病诊断上有逐渐代替IFA的趋势，但存在标准化问题，目前在临床上还未推广使用。

5．ELISA法：

ELISA具有免疫反应的特异性和酶促反应的高敏感性，是一种简便灵敏的血清学诊断方法，可能会替代IFA和1IP。Kim等利用来自不同血清型的Ot嵌合抗原cr56与r21、kr56两个抗原重组，既增加诊断恙虫病的敏感性，又可降低与其他发热性疾病的交叉反应。

Prakash等利用潜类别分析发现，ELISA法与套式PCR比较，特异性低，敏感性高。该方法适用于流行病学调查选用，具备酶联免疫检测仪的医院可用于临床诊断，但易受如酶标抗体质量等因素影响，且检测的血清型有限，易漏诊。

6．免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique)：

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物的一种新型免疫标记技术。胶体金除可与蛋白静电结合外，还能与如葡萄球菌A蛋白等许多生物大分子结合，且不影响它们的生物学特性。

常见技术有免疫胶体金银染色法、斑点免疫金电子显微镜染色法、斑点免疫金渗滤法和胶体金免疫层析法等。

袁庆虹和张海林利用金标免疫层析法检测恙虫病IgM、IgG和总抗体的敏感度分别为62．25%、30．12%和93．98%，特异度分别为98．11%、98．74%和96．23%，且认为可替代常规IFA检测。

于乐成等发现，胶体金免疫色谱法(CIA)诊断恙虫病，阳性率为100%，特异度为94．1%。免疫胶体金技术检测快速、简便，15 min即可肉眼观察，无需特殊仪器和专业人员指导，但不易定量；存在抗原过剩，标本需稀释测试，质控指标不一的缺陷。

胶体金技术目前在临床上主要作为快速粗筛的检测手段，对阳性和可疑阳性的结果还需用其他更为可靠的技术检测。

7．斑点印迹法(dot—blot assay)：

斑点印迹法是利用硝酸纤维素膜(NC膜)或乙酸纤维素膜作为固相支持物，进行抗原一抗体反应的免疫学检测方法。Kim等利用重组抗原进行斑点印迹法检测Ot抗体，以提高诊断的敏感性。

斑点印迹诊断试纸适用于鉴别由交叉反应造成的真、假阳性结果，即用于筛选可疑感染Ot的患者，且简易、耗时短、经济，可做半定量分析，尤其适合现场调查应用，可作为快速粗筛的检测手段；但仅能检测部分型别，有一定局限性。

8．噬菌体抗体库技术：

噬菌体抗体库技术旨在从中筛选出可用于恙虫病早期诊断的目的抗体，为研制恙虫病的快速诊断试剂盒奠定基础。该技术最大的优点是实现了Ot表型和基因型的统一，模拟天然全套的抗体库；与杂交瘤技术相比，具有简便、快捷、生产成本低、筛选容量大、可大量制备、可获得高亲和力的人源化抗体等优点。

黄会等构建抗Ot噬菌体抗体库，用经过纯化的重组抗原Sta56为抗原对抗体库进行4轮筛选，在“吸附一洗脱一扩增”的富集筛选过程中，回收的噬菌体比率逐渐增加，4轮增加了约160倍；并用ELISA法对富集后的噬菌体抗体进行抗体特异性检测，获得7株阳性克隆。该技术目前尚未应用于临床诊断。

9．快速免疫亲和层析流体试验(RFA)：

Ching等在重组Ot r56外膜蛋白的实验基础上，建立双向条带状膜片的流体实验。采用独特的双向NC膜，可同时检测Ot的IgM和IgG。RFA检测血清中IgM和IgG抗体的灵敏度和特异度均较高。Silpasakorn等‘421发现，该法在临床早期诊断恙虫病，比传统的免疫荧光法具有更高的灵敏性和特异性。但免疫亲和层析载体价格昂贵，机械强度低，配基制备困难，不适于临床诊断应用。

10．比色法(colorimetry)：

比色法可用于测量血清腺苷脱氨酶(ADA)活性，在恙虫病流行地区的流行季节，当急性发热患者出现ADA>25 u/I。时，可考虑恙虫病，此时诊断的灵敏度为92．3%，特异度为86．6%。

11．一般实验室检查：利用全自动生物化学仪可检测恙虫病患者血常规，患者白细胞计数常减少或正常，有其他并发症时白细胞计数可增多。

研究发现，异常淋巴细胞的检出和ALT的升高对恙虫病的诊断也有参考意义，但特异性不强。

三、分子生物学诊断

恙虫病诊断的分子生物学技术，大都基于PCR检测方法，随着它和核酸杂交技术、基因芯片技术的发展，恙虫病的诊断取得很大的进步。

1．PCR：

1990年后PCR技术就被广泛应用于检测Ot。用于检测的基因主要有16S rRNA、47 000蛋白编码基因、56 000编码基因、58 000编码基因和groEL基因，其中对56 000编码基因研究最为多见。

Ha等发现，表面细胞抗原(sea)家族基因编码的转运蛋白可用于恙虫病的诊断。恙虫病PCR常用标本包括血、焦痂。

在恙虫病急性发病期抗体浓度较低时，往往不适于血清学检测，此时可结合应用PCR。PCR可用多种引物来提高检测的敏感性，但提取DNA过程较繁琐，易发生交叉污染，假阳性率较高，受设备和技术的限制难以在基层医疗机构推广应用。在有条件的医院，可作为恙虫病确诊的方法。

2．套式PCR：

自1993年Furuya等利用套式PCR对Ot进行血清型特异性扩增后，套式PCR成为常用的技术之一，可用于诊断恙虫病。

2006年Kim等用套式PCR法检测患者外周血，其敏感度为82．2%，特异度为100．0%。套式PCR可检测200 Pg的DNA，灵敏度是传统PCR的100倍，克服了恙虫病患者发病初期抗体效价太低，难以进行血清学诊断的问题。

Kim和Byun发现，套式PCR在抗菌药物使用前检出率为90．5%，而在服用抗菌药物3 d后检出率仅为60．5%，第4天降到10%，故建议临床医师在使用抗菌药物之前或发病3 d内进行PCR检测。

国内的研究学者也发现，套式PCR可用于Ot特异性基因的检测，且在Ot感染早期，较血清学试验更敏感。在临床上主要用于疑似患者的确诊和基因型别的鉴定。

3．实时荧光定量PCR(qPCR)：

qPCR包括荧光染料法和TaqMan探针法。2011年Kim等应用发热<4周患者的血标本比较PCR、套式PCR和qPCR，发现检测Ot的灵敏度分别为7.3%、85．4%和82．9%，特异度均为100．0%。Watthanaworawit等发现，qPCR检测Ot的特异度为99．4%，灵敏度是双份血清IgM IFA检测的2倍。

qPCR检测Ot的16S rRNA基因，发现Ot DNA载荷与病情的严重程度呈正相关。利用TaqMan 小沟聚合物探针(minor groove binder，1VIGB)优化后的qPCR可发现的检出浓度为2拷贝/uL的ENA，特异性、灵敏性均优于PCR，能更早检测到Ot，且具有良好的重复性，能快速分析Ot基因型。

结合检测的灵敏度、特异度和速度，最适合诊断恙虫病的方法为qPCR。由于qPCR不能检测扩增产物的大小、复合式检测(用多对引物同时扩增几条DNA片段)的应用能力不足、成本较高，且要求操作者有一定的技术水平，目前在临床上应用尚少。

4．聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析(PCR--RFLP)：

Yang等利用PCR--RH，P在中国台湾东部发现新的基因型的Ot变异株。该法与传统的血清学鉴定法比较，快速敏感，不受血清学交叉反应的影响，可方便地鉴定Ot的基因型，该法可用于研究Ot基因型及其分布，从而对恙虫病予以深入研究。与DNA序列分析法比较，更加简单经济；但操作复杂、技术要求高，不适合临床诊断之用。

5．环介导等温PCR检测(LAMP)：

2000年Notomi等公布该基因诊断技术。2008年Paris等报道LAMP是一种快速、简便、敏感检测Ot的方法，能检测4～44拷贝/uL的基因。

在恙虫病早期，LAMP法的特异度和灵敏度与即时PCR和套式PCR均相似，且优于依赖抗原的快速诊断技术。

Blacksell等将快速检测试纸(rapid immunochmmatographic test，ICT)与LAMP联合检测Ot，灵敏度可提高lo%～20%，特异度降低5%。LAMP整个反应均在同一温度，只需水浴锅和加热器，不需要特殊仪器，如热循环加热器，操作简单；但该技术易形成气溶胶污染，假阳性问题严重，且引物设计要求高，临床上现阶段不建议使用。

6．基因芯片技术：

利用核酸扩增技术将样品核酸进行荧光标记，然后与基因芯片阵列中的相应寡核苷酸探针进行杂交，通过激光共聚焦荧光扫描检测荧光信号强度。

操敏等根据Ot 56 000外膜蛋白基因序列，设计群特异性引物和探针，制备寡核苷酸芯片，用Cy3标记的引物，利用不对称PCR技术扩增DNA片段，将扩增的DNA片段与芯片上的探针杂交，用荧光扫描仪监测分析信号，制备能检测Ot标准株的DNA基因芯片。

刘昌政等分析Ot 56 000 TSA蛋白序列中的变异区和保守区，为恙虫病的蛋白和核酸诊断提供参考。基因芯片技术特异性高，检测迅速，但对设备和操作人员的技术要求高，检测成本也较高。

四、小结与展望

恙虫病的发病率不断升高，疫区范围不断扩大，患者常因被误诊而贻误最佳治疗时机，从而导至严重的并发症，甚至死亡。

因此，有效的诊断方法对于防治恙虫病具有重要的意义。综上所述，临床诊断恙虫病的血清学技术仍是很有价值的方法。

IFA虽有血清型限制、需要双份标本、仪器设备要求高，但其具有较高的灵敏度和特异度，是诊断恙虫病的金标准。wFT易出现交叉反应，灵敏度和特异度低于IFA，但价格低廉易操作，可作为初步诊断使用。

liP灵敏度和特异度与IFA相似，且仅需要普通显微镜即可．但存在标准化的问题，还未在临床推广使用。PCR诊断灵敏度和特异度高，但操作复杂、需要一定技术和相应的仪器设备，有条件的医疗机构可予应用。

快速诊断试纸操作简单，30 min内可快速诊断，灵敏度、特异度与IFA相近，但有血清型的限制，易出现误诊。

在现行临床诊断标准瞳妇的基础上建议：①临床医师应提高对恙虫病的重视程度。我国恙虫病一年四季均有病例报告，但不同地区呈现一定的季节性。

应明确与当地其他常见的发热性疾病，如肾综合征出血热、钩端螺旋体病、流行性乙型脑炎等的鉴别诊断，发现有典型临床表现的可及时予以特异性抗菌药物治疗，以降低发生并发症的风险。

对于无焦痂和溃疡的患者不可轻易排除诊断，应全面了解流行病学史，进行病情分析，并辅以必要的实验室检查，以确定诊断。

②诊断设备有限的基层医疗机构，在分析流行病学资料和临床观察的基础上，可采用wFT或简单的快速检测试纸予以诊断。如不能确诊，可由上级医院或疾病预防控制机构协助检测。通常对快速初筛可疑或阳性患者进一步采用IFA、IIP或FCR检测予以确诊。

③在恙虫病流行地区，应开展流行病学调查，确定本地区血清学诊断的临界值，了解Ot在患者、宿主和恙蟥的型别和分布特点，从而为现有诊断技术的完善和评价、新诊断技术的发展和疫苗研制提供理论依据。

在验证、评价新的诊断方法时，不单依靠IFA，丽应联合应用血清学和分子生物学分析方法，如IFA与47 000和(或)56 000 PCR。

中华传染病杂志2014年2月32卷2期