中心实验室和POCT未来技术支持急性心血管疾病治疗吗？

青草

旧金山加州大学Alan H. Wu博士于2013年8月1日在AACC年会上以肌钙蛋白为例来讲解，中心实验室和POCT未来技术在临床实践中的应用，并回顾了多家公司的新技术，让我们对未来POCT创新趋势一目了然。

心肌肌钙蛋白

        从当前这一代灵敏度检测到高敏检测，心肌肌钙蛋白的标尺升高了。目前我们并没有高敏检测，急诊科更不可能用它们来加快周转时间。坏消息是大家不想成为患者，不一定非要这种服务。好消息是我们都有工作，都有事要做。
       美国心脏病学会(ACC)/美国心脏协会 (AHA)对不稳定心绞痛（UA）患者的指南 [Circulation 2000;102:1193-1209]指出，当一个中心实验室用于测量生物化学心脏标志物时，结果应该在60分钟内获得，最好在30分钟内获得。这项要求是合理的，我们实验室就有可能满足这个要求。但是，很多急诊科医生不太可能在30分钟内获得结果。

中心实验室与POCT

       我们可以实现30分钟周转时间，中心实验室也能。然而，同时如果我们实施了当前一代的床旁检测（POCT），我们就会有其他局限性。你能承受和接受这些局限性吗，还是将牺牲周转时间？长远来看，中心实验室与POCT谁会赢？我认为最后POCT会赢。不过，当下情况并不是这样。
       对于心脏标志物POCT，我们讨论全血平台，讨论定量和定性检测（最初一代是定性），可以显著降低检测TAT（周转时间）以满足30分钟的指南要求，但是从全面上来说精密度和灵敏度不如中心实验室平台。我们甚至没有讨论中心实验室的下一代高敏检测，所以差距在拉大。

       上述5个研究明确表明如果在急诊科使用POCT，可以降低周转时间。在我们实验室，周转时间大约为50分钟，该报告显示大约90分钟。但是，我们需要降低到也许30分钟。

心脏标志物POCT策略

       心脏标志物POCT有最初的定性试纸，和定量测流床旁检测设备。测流设备使用各种阅读器，尽管没有我们所需要的分析灵敏度或精密度，但是我们可用的。事实上测流市场巨大，不仅在临床化学领域，还有兽医学，食品饮料，药物，环境等。这是我们非常熟悉的一项技术，如表2.1所示，临床领域占主导地位。在临床领域内，有怀孕、脂类、吸毒、非处方药等，心脏标志物也处于主导地位，虽然它是最大的但不一定是最好的。见表2.2。

       其他策略包括台式定量全血分析仪，微流体学。台式定量全血分析仪有分析灵敏度或精密度，与中心实验室成竞争关系，但并不是高敏检测，仍不能做到我们需要在5年内实现的目标。i-STAT不是特别灵敏或精密，但是首批采用微流体学的设备之一。因此我想传达的概念是，与更符合未来需求的程序相比，我们能从不精密的床旁检测过程获得什么。
       高敏肌钙蛋白：谁领先？很明显，中心实验室领先于POCT。表3突出显示的是当前一代床旁检测，都属于水平1，这些是好的检测，符合指南要求但不是高敏检测。相比之下，下半部分列出的研究用检测是高敏检测，这个列表上的高敏检测均不是POCT。

POCT与中心实验室检测的差异

       POCT与中心实验室之间的灵敏度存在差距吗？当然有差距。“当心差距”就够了吗？答案是否定的。如果我们使用不精密的测流床旁检测设备，我们就不能提供所需水平的服务。
       很多研究都展示了图1。在本图中POCT指i-STAT，也可以为任何其他；对比检测为Architect，不是高敏检测。i-STAT 的截断浓度是0.08μg/L，Architect的截断浓度为0.3μg/L。这些患者均没有心脏病，但是检测结果呈阳性。使用中心实验室检测，可能漏掉床旁检测设备发现的结果。可能有些患者回家了，有些患者30天内回来了，我们把他们漏掉了。

       中心实验室如何提高分析灵敏度？其中一个策略是用两种以上抗体，有点像“三明治”，上下和夹层。如果有两个以上抗体，就可以检测之前因为没有抗原决定部位而漏掉的片断。整体概念就是灵敏度即尽可能多检测。其次，使用嵌合抗体。我们从完全鼠抗体，人抗体，到人源化抗体（有鼠的成分，Fab 片断有抗原决定部位），嵌合抗体（活性很强）。这些对于分析灵敏度来说都是很好的改进。只通过增加样品量，增加培养时间，我们也能够获得高敏检测。
       使用单分子检测的中心实验室平台类型，是最好的肌钙蛋白检测之一，尽管未经过FDA批准。具体做法是用微细管流提高信号噪音比，尤其是噪音逐渐降低，从而给出很高的信噪比。
       这些都不能使我们实现30分钟周转时间。所以，我们需要思考POCT策略。事实上我看到了两种不同的策略，那么我们可以从历史中学到哪种策略将占主导地位吗？
       两个方向：手持型设备与可以随意带到窗旁的微型设备，某种基于试剂盒的系统或某种阅读器，某种像盒子一样大小或稍大的卫星台式仪器，可能需要位于急诊科的中心位置。这两种策略中哪个将占主导地位呢？
       如图2所示，Instrumentation Laboratory（IL）代表基于试剂盒的台式POCT仪器，iSTAT代表手持型设备。至于血气分析，我们必须从中心实验室转向床旁检测。如这两个公司的成功所示，使用他们的设备增加了更加传统的中心实验室血气平台的成本。我还列出了雷度米特（Radiometer），其中心实验室检测平台几年前占据优势，但是他们认识到床旁检测设备才是最好的选择。他们已经采取措施了，你可以看到他们是如何渗透床旁血气检测市场的。至于哪个策略最适合你的实验室？我无法告诉你。

       但是，至少我们可以通过看楼层平面图得到线索，图3是我下载的一个急诊科平面图。最下面是他们所说的快速通道，我们希望把所有胸痛患者都放在这些床位，那里是不错的中心位置，护士站就在旁边，也许这种几何学有助于使用台式分析仪，因为他们方面采取措施。与图3相反，图4的快速通道和急症护理之间有些距离，可能他们使用的是手持型POCT设备。所以我认为两者将共同发展，后面我们将看到利用这些概念的不同类型策略。

       在看那些之前，我们可能会问我们能改善测流吗？测流已经废弃，还是我们可以做点什么来挽救？去年发表的一篇文章（Linares et al. J Immunol Methods 2012;357:264-70.）描述了不同的颗粒，我们可以看到有金纳米颗粒，银包被金纳米颗粒，蓝色乳胶颗粒，炭黑。研究者表示虽然金纳米颗粒是金标准，但事实上炭黑可能更好。这些数据表明利用不同的颜色或不同类型的颗粒可能得到更高灵敏度。

      

       本周我在AACC会议上见到上述这种产品（图6），但没体验过。我们用手机把测流图片照下来，然后发到该条码阅读器上，读取结果。这种设计更适合产生条状结果的定性POCT设备。但是如果可以使读取方法标准化，那我们所需要的就是用智能手机照张图片。我认为这是一种很聪明的做法。

POCT创新

       抛开测流，我们需要思考下一代POCT创新是什么。很多年前的一部电影，Dustin Hoffman主演的毕业生的一幕，导师告诉Hoffman，“一句话，未来就是‘塑胶业’”。而我想POCT创新的未来就是微流体学。
       为什么未来趋势是微流体学而不是测流？我认为测流的一个问题是被动传送样品（passive delivery of sample），在一定程度上取决于免疫层析重力减弱及传送分析物和试剂的精密度，不可能好。如果你有复杂的生物基质比如血液，差异大到令人难以接受，蛋白含量不同，物质不能预测，就不可能像电脑控制传送类型那么好。如图7所示，输入液体样品，溶解或RBC过滤，阀门，液体流动，缓冲液，单元窗口（cell windows），废弃物容器。因此，这是我们将看到的一些设备的未来，即下一代微流体学设备 。

       例如，边长分别为1、2和3的立方体，最大的表面积与体积比？结果表明最小的立方体，其表面积与体积比最大。那么放眼于床旁检测设备呢？我们将关注发生在非常小表面的反应，比如纳米管、纳米球、纳米碳颗粒，这是很多人关注的。

Nanomix公司：使用纳米管（CNTS）增加表面积
       你能看到这些管有多小，细菌1μm，病毒100nm，而这些管只稍微大于DNA，所以我们可利用这些表面积与体积比较高的设备使分析物加速暴露于抗体包被反应表面。
       CNTs网络创造了高表面积与体积的比和强大的生物分子亲和力：
-通过被动和共价功能高密度捕捉抗体
-增强生物特征稳定性
-更快的反应速率使信号强度和灵敏度提高
-低应用电位使噪音降低
-提高信噪比和准确度
       除了加速流动，提高表面积与体积比，还有新型检测体系。我认为我们将结束用眼观察反应的时代，我们将利用下一代视觉增强检测体系，不仅包括目测，还超越直线观察。

Nanosphere公司：纳米颗粒

       数年前Nanosphere公司确实有肌钙蛋白检测，算是应用先河，不过已经退出。我不能百分百确定其心脏标志物STAT是多少，但是仍非常活跃于其他领域。他们利用传统微探针与纳米球结合，通过将纳米球与DNA条形码探针相连来增强检测。讲到DNA，你就会想到PCR扩增的可能性，所以这是一项信号扩增技术，可用作蛋白标志物，本身也可作为DNA探针。

Nanomix公司

电化学检测：
       电化学检测具有很多优势，因为我们不用烦恼干扰，谱干扰。而且电化学检测的特异性优于目测或者甚至荧光检测，所以很多公司将用某些类型反应氧化还原探针，用电流测量提高分析灵敏度。
ReLIA 3 POC检测技术：
       该公司还涉及红外光检测。在临床化学中，检查红外光区有很多优势。因为分析干扰通常发生在白光光区（可见光区）而不是红外光区。所以，红外光检测对于减少背景噪音和提高信号有增强功能。

Quanterix公司：飞升单位（femtoliter）细胞

       在本周之前我从未见过这种概念，但是印象非常深刻。我们知道毫升、纳升，现在讲飞升反应细胞，令人十分兴奋。他们将包被微珠放进含飞升反应细胞的阵列中，上面用油密封，清除未结合的探针，最后测量孔中的荧光团。有单分子计数。从我见到这项技术开始，我认为很有可能实现超高分析灵敏度，以飞升/飞摩尔浓度的灵敏度。灵敏度可能小10-100倍，检测限小于我们至今拥有的一切包括中心实验室。对于肌钙蛋白，实际上可能有些过度反应了，因为现在我们已经不需要查看低于正常水平的水平了，没有临床意义。但是如果这项技术用于其他标志物，我们还不清楚会怎么样，因为浓度如此低，我想这有待观察。我在该公司或对这件事没有知识产权利益。
       然后我们考虑了一种无标记类型技术（无探针），叫做表面等离子体共振。我们有流室，用光刺激分子振荡，当光频率与电子振荡一致时共振产生。当分析物集合于薄金层时，捕获分析物。表面等离子体共振变化，这种信号变化仅仅是由于这些材料的物理吸收特征，这可以用适当的检测仪检测。所以，我们可以不必使用探针。

多分析物分析

       另一个未满足的需求和下一代试验所需的是多标志物分析。如果我们需要进行不止一个试验，那么我们就需要可以进行多标志物分析的平台。这是一个焦点。如图8所示，7-8年前得克萨斯州立大学西南医疗中心James deLemos发表了一篇文章，研究所有这些不同的分子，ACS和心衰的生理学途径。现在其中很多分析物都不用了，我认为将来我们不止需要做高敏肌钙蛋白。所以为了这一天做准备，我们需要拥有高敏检测和多路功能的工具。

Proxim公司：多路电化学（EC）检测

       你可以看到很多不同的传感器，同时整合在一个芯片上。Proxim检测系统相对于传统ELISA的优势：
1. 飞摩尔检测限，>100X，比ELISA更灵敏
2. 多达5个靶标
3. 较宽的动态范围，多达4个数量级
4. 周转时间小于15分钟
5. 低样品量，50-200μL
6. 从原样品到出结果完全自动化的检测过程

其他公司如Cyvek：玻璃纳米反应器

       Cyvek公司使用纳米反应器，其优势在于直径非常小，跟头发大小差不多。这些空心管排列成一种试剂盒。你可以执行多个反应，由于微流体学这些反应完全独立于彼此。微流体学将样品分离到单个腔室内，有点像随机存取临床化学分析仪。
微流体学“多分析物但非多元”
       在做多元反应时重要的一点是一个反应不影响另一个反应。该卡片如下图9所示，有很多孔、缓冲液等，但都是自包含的，无需用户做任何事。

Cyvek公司：独立反应提高灵敏度

       这些数据比较单独IL5检测项目以及结合UIL1β和IL10等检测项目，还有 3元、4元反应。在某些系统中，随着分析物数量增加，分析信号减少。由于各自独立，所以这是多反应设备，而不是多元设备。

其他创新：互补金属氧化物半导体（CMOS）

磁敏电阻传感器-MagArray
       有一些新方法，图11是来自斯坦福大学研究组的MagArray，他们称之为磁敏电阻传感器。高度磁敏颗粒用作探针，附于二级抗体。巨磁敏电阻传感器（GMR）检测存在的信号。有趣的优势是信号对基质不敏感，不需要清洗。这项技术用于硬盘阅读器，所以你的电脑要有硬盘，该传感器位于硬盘最前面。

Silicon Biodevices：芯片实验室

       Silicon Biodevices是芯片实验室。如图12所示，你可以看到一个手持设备，将血液滴到过滤器内，过滤器下面是包含磁颗粒的干燥试剂，这跟我们在当前实验室所做的相似。我们有微颗粒和所需的间隔。就像测流一样，有一个包被了抗体的区域，可能是质控抗体和靶抗体。

       芯片的作用就是分离结合物，如果颗粒没有附于阵列抗体，它则移动到旁边（图13上半部分）。如果附于抗体上，它则停留在有传感器的表面。添加磁珠之后形成图13下半部分左侧结构。末端是没有结合的颗粒，中间是有抗体的分析信号。中间信号越多，表明肌钙蛋白浓度越高。

CardioCanary公司

病人体上检测：
       我们甚至考虑实验室以外的设备，有些公司研究附于患者身体的设备。这不是体内传感器，而是体上传感器。

基于导管的系统：
       这种概念目前尚不存在，但是你可以看到一个小的试剂盒（耗材），附于手臂的阅读器，还有微流体学。假设你想在第0、3、6个小时做检测，你可以将该设备绑在手臂上，设定时间，用设备进行采样，测量和报告，解释结果。

Seventh Sense Biosystems公司

       Seventh Sense Biosystems 拥有一个血液采集设备，非常独出心裁。该TAP系统穿透最上面的皮肤层，利用新型微流体学提取过程使血液转移到综合收集库。提取的血液可在现有的诊断仪器上进行分析或者与完全整合的从样品到结果的测试连接。

       TAP只是用于无痛收集少量血液的独立设备，也许将来可连接至某些类型的床旁检测设备。但是也许我们可以看到这种下一代体上诊断设备不仅可以收集血液，还可以在同一个试剂盒内做检测。随着时间流逝我们也许可以做多元检测，目前其尚未应用于心脏标志物，因为免疫测定比我们当前想象的在ICU环境中监测血糖更难。我认为有价值这样做，我只是想知道一个患者在24小时内每小时的血糖或者在18小时内每6小时的血糖。也许这种设备可用于此类情况。
       有些公司检测泪水中葡萄糖，心脏标志物需不需要做泪水分析，我不确定。总之，下一代床旁检测技术的时代即将到来。

                                                                                               本文编译：《临床实验室》王小茜

                                                                                    摘自定向点金《临床实验室》杂志2014年第三期

jonsong

这是图都挂了的意思么。。。。