一种he4量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒及其应用

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说明

一种HE4量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒及其应用

技术领域

[0001]        本发明涉及免疫诊断技术领域，特别涉及一种人附睾蛋白4 (HE4)量子点双夹心免疫分析检测试剂盒及其应用。

背景技术

[0002]目前，卵巢癌一般使用两种检测方法，但都有其局限性:1)经阴道超声检查(TUV)不能准确地检测出肿块的良、恶性，同时还需要有极富经验的临床技术人员对结果进行正确的解读；2) CA125这一生物标志物现被认定为卵巢癌诊断的“金标准”，但也有其局限性，大约50%的卵巢癌I期患者并没有CA125水平升高的现象，而且某些良性卵巢疾病也会导致CA125水平升高。CA125的较低敏感度及特异性会导致出现假阴性或假阳性。人附睾蛋白4 (HE4)属于乳清酸性4-二硫化中心(WFDC)蛋白家族，此蛋白大概为20kD～25Kd。有报道认为HE4在多个正常组织(包括呼吸道和生殖道组织，以及卵巢癌组织)的上皮内均有所表达。分泌型HE4已经在卵巢癌患者的血清中检测到有高水平表达，88%的卵巢癌患者都会出现HE4升高现象。在随后一项对卵巢癌相关的大量生物标志物的评价研究中，HE4检测卵巢癌时具有最高的灵敏度，尤其是在疾病的早期阶段。疾病早期HE4诊断的敏感度是82.7%而CA125却仅有45.9%，HE4的敏感度大大超越CA125。因此，HE4作为一种新的肿瘤标志物，将HE4测定试剂盒与CA125检测试剂盒联合使用，能够帮助进行卵巢癌的早期检测及风险评估。

[0003]目前用于人附睾蛋白4        (HE4)的免疫方法主要为酶免疫测定。但是，酶免疫分析法灵敏度低，影响因素多，易造成假阴性和假阳性。量子点(QDs)具有连续而宽的激发光谱〃其荧光可以被波长小于其量子限域峰的任意光源所激发〃并且荧光谱峰位置可以通过改变QDs的物理尺寸进行调控，这样仅用一种波长的激发光源便可激发多种不同颜色荧光的QDs"进行多元荧光检测，而有机荧光染料"每种颜色都需要不同波长的激发光源”，此外"由于QDs的这种光学特性"我们可以在其连续的激发谱中选取更为合适的激发波长"从而使生物样本的自发荧光降到最低点，提高分辨率和灵敏度。因此，量子点免疫分析法远远优于酶免疫测定。用量子点免疫分析法检测人附睾蛋白4 (HE4)是先进而有效的方法，能够有效的提供临床检测的灵敏度及特异性。

[0096]        1、检测方法


[0097]        在本实施例中，利用实施例2中获得的纯化的兔抗人HE4多克隆抗体作为捕获抗体，实施例3中CdTe量子点标记的鼠抗人HE4单克隆抗体作为检测抗体，建立卵巢癌肿瘤标记物HE4的多抗和单抗双夹心量子点荧光免疫检测法。


[0098]        2、酶标板的包被及封闭


[0099]        pH9.6碳酸盐缓冲液稀释多克隆抗体至最适浓度I μ g/孔，量100 μ I/孔，放入湿盒，4°C过夜；次日弃去包被液，PBST洗涤酶标反应孔4次，每次5min，甩干，5%牛血清白蛋白300μ I/孔封闭，放入湿盒或干燥的金属薄袋内，4°C过夜。


[0100]        3、标准品或被检血清的处理


[0101]        HE4蛋白标准品(阳性标准品)或被检血清用样品稀释液(含1%BSA和0.05%的吐温-20的PBS)做适当比例的稀释，不加血清的样品稀释液作为阴性标准品。IOOul/孔，37°C反应I小时后用洗板液洗板3次，将酶标板拍干。


[0102]        4、标记后的单克隆抗体的处理


[0103]        CdTe量子点标记的鼠抗人HE4单克隆抗体溶于含50%甘油的PBS中，用PBS稀释单克隆抗体1:10000稀释后使用，现配现用。IOOul/孔，37°C反应I小时后用洗板液洗板3次。拍干后加入IOOul PBS0


[0104]        5、分析检测


[0105]        将处理好的酶标板经由荧光酶标仪(激发波长511nm，发射波长548nm)测定荧光强度值。建立标准曲线，得到检测限(L0D)。


[0106]        6、试剂盒性能指标考核


[0107]        (I)试剂盒的检测区间


[0108]        取包被好兔抗人HE4多克隆抗体并进行封闭的酶标板，将HE4蛋白标准品做适当比例的稀释，每个样品做3个重复孔。IOOul/孔，37°C反应I小时后用洗板液洗板3次，将酶标板拍干。CdTe量子点标记的鼠抗人HE4单克隆抗体溶于含50%甘油的PBS中，用PBS稀释单克隆抗体1:10000稀释后使用，现配现用。IOOul/孔，370C反应I小时后用洗板液洗板3次。拍干后加入IOOul PBS0将处理好的酶标板经由荧光酶标仪(激发波长511nm，发射波长548nm)测定荧光强度值。以不同浓度的HE4的标准品蛋白为横坐标，以相应的荧光强值为纵坐标，绘制曲线。


[0109]        结果，如附图4所示，本试剂盒具有良好的线性关系的检测区间为10pM-1000pM.，如果被检测血清超过ΙΟΟΟρΜ，建议用样品稀释液稀释后再进行检测。


[0110]        (2)试剂盒灵敏度(最低检测量)


[0111]        以零参考标准品(A点)当作标本测量20次，计算其荧光值均值及标准差。以A点测定值的均值加上2倍的标准差所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出的浓度为其最低检测量。


[0112]        结果，最低检测量为<5pM。


[0113]        (3)试剂盒的稳定性


[0114]        将自制试剂盒的三批试剂分别放置于4°C半年及一年，37°C放置7天后，比较与放置前参考标准品各点荧光强度值间的线性关系及零标准品荧光强度值，测试稳定性。[0115]        实施例5:抗人HE4Elisa检测试剂盒的评价


[0116]        检测200例平均年龄为41岁女性血清中HE4的含量，其中50例平均年龄为35岁体检的健康女性作为正常对照组(n=50)，150例因卵巢肿瘤住院治疗患者，按照其术后病理诊断结果进行分类，其中86例为良性肿瘤，64例为恶性肿瘤。检测结果为:正常对照组血清中HE4含量的范围是18～40.0pmoI/L,均值为31 ±4.39pmol/L ；良性肿瘤组血清中HE4含量的范围是25～73.0pmol/L，均值为42±9.2pmol/L ;恶性肿瘤组血清中HE4含量的范围是54～1263.0?11101/1，均值为476±356.6pmol/L ;恶性肿瘤组HE4水平明显高于其他两组，差异具有统计学意义(P〈0.01 )。


[0117]        综上所述，尽管本发明的具体实施方式对本发明进行了详细描述，但本领域一般技术人员应该明白的是，上述实施例仅仅是对本发明的优选实施例的描述，而非对本发明保护范围的限制，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围之·内。




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007

可惜没有图片，这个是楼主的专利吗。

ty10086

007 发表于 2014-4-2 08:44
可惜没有图片，这个是楼主的专利吗。

QDs的图片吗？
网上有很多啊