分子诊断学在临床医学中的应用进展

青草

分子诊断学是以分子生物学理论为基础,利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化,为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。分子诊断学是利用遗传学、病理学、免疫学、生物化学、基因组学、蛋白质组学和生物信息学的理论和方法,探讨疾病发生和发展的分子机制,对疾病的诊断、治疗效果的评估、预后判断及预防等方面都发挥非常重要的作用。现将近年来分子诊断学的最新研究进展及其在临床医学中的应用进展综述如下。

1、分子生物学的发展概况

       分子生物学是研究核酸和蛋白质生物大分子物质的结构、功能、遗传、调控变化、相互作用和相互关系,从分子水平上研究和探索生命现象的科学。分子生物学的发展历程大致分为三个阶段:

       1.1 19世纪后期到20世纪50年代初,是分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。这个阶段对生命本质认识上有两大突破:一是确定蛋白质是生命的基础,二是确定了DNA是生物遗传的物质基础。

       1.2 20世纪50年代初到70年代初,是现代分子生物学建立和发展阶段。这个阶段的主要进展包括:一是发现mRNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶;二是提出DNA半保留复制机制、操作子学说等重大理论;三是发现遗传密码并证明其通用性,1966年Nirenberg,Crick和Ochoa等破译了人类64个遗传密码,建立了生物遗传的中心法则:遗传信息的流动方向是DNARNA蛋白质,1970年逆转录酶和逆转录现象的发现使中心法则得以进一步修正完善。

       1.3 1975年Sanger和Gilbert建立了DNA分子中核苷酸顺序分析法,在这些基础理论和基本技术的基础上,建立了重组DNA基因工程技术即分子生物学的核心技术。这个阶段是初步认识生命并开始改造生命的深入发展阶段,以基因工程技术的出现作为新的里程碑,标志着人类深入认识生命本质并能改造生命的新时期开始。这个阶段主要进展包括:重组DNA技术的建立和发展、基因组研究的发展、单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展、基因表达调控机制和细胞信号传导机制研究。

2、分子诊断学的发展概况

       分子生物学的发展过程,推动着整个生命科学的发展,也推动分子诊断学的发生和发展。分子诊断学的发展历程大致分为三个阶段:

       2.1 分子诊断学的诞生应追溯到1978年,美籍华人Kan等学者利用液相DNA分子杂交技术对地中海贫血进行基因诊断,标志着分子生物学技术进入基因诊断时代。这是分子诊断学的初期阶段,主要利用DNA分子杂交的方法来进行遗传病的基因诊断,所能检测的遗传病种类也比较少。

       2.2 1983年发明聚合酶链反应(PCR)技术之后,因为PCR技术只需要简单的操作就可以在普通实验室条件下大量扩增靶DNA序列,突破了以往研究中不易获得丰富靶DNA瓶颈,在分子生物学技术领域引发了一场革命,PCR技术由于操作简便、快捷、适用性强,已广泛应用于分子生物学领域。

       2.3 以生物芯片(biochip)技术为代表的高通量密集型技术。根据芯片上的固定探针不同,生物芯片包括:基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等。传统核酸印渍杂交存在技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足,而生物芯片技术是将极其大量的探针同时固定于支持物上,因此一次可以进行大量检测和分析。生物芯片还可以进行基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序。由于生物芯片的工作原理和样品结果处理方面远远优于传统的检测方法,具有样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点,有广阔的应用前景,生物芯片的运用已成为分子生物学技术领域的一大热点,大大促进了分子诊断学科的发展。

3、分子诊断学在临床医学中的应用

       由于DNA重组技术、转基因技术、基因组学、蛋白质组学、基因治疗、生物芯片等技术应用到临床医学领域,对疾病机理的研究、疾病诊断、治疗和预防产生了深刻影响。分子诊断不仅能对疾病早期作出确切的诊断,也能确定个体对疾病的易感性、判别致病基因携带者并对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断。

       分子诊断已经成为实验诊断学的一个重要组成部分,成为一门新的学科,即分子诊断学。分子诊断的内容从初期的单一诊断遗传性疾病发展到一个全新阶段,广泛应用于感染性疾病、肿瘤及遗传性疾病诊断等多个医学领域。当前分子诊断学在临床医学上应用主要有以下几个方面:

3.1 在感染性疾病诊断中的应用

       由于病原物微生物导致的感染性疾病严重威胁人们的健康。以前对这些病原体主要依靠病原学和免疫学方法检测,但是这些方法受敏感度和特异性的限制,使感染性疾病的诊断受到限制。随着各种病原体基因结构的阐明,利用分子诊断技术能早期、快速、敏感、特异地检测感染性病原体的DNA或RNA。分子生物学技术不仅能对微生物感染作出诊断,还可以对感染性病原体进行分型和耐药性监测,因此,在感染性疾病的诊断、流行病学调查、微生物分类分型研究中均可显示其特别强大的功能。众所周知,乙肝病毒、丙肝病毒感染可以引起病毒性肝炎严重威胁人们的健康。运用酶联免疫法(ELISA)检测肝炎病毒作为传染性判断依据有一定局限性,但许多研究结果显示,运用分子生物学技术检测肝炎病毒含量(如PCR定量技术、蛋白芯片技术等),其敏感度远远高于酶联免疫法,更能反映肝炎病毒复制情况,对病毒性肝炎的早期诊断、分型、评价疗效及预后判断更具有临床意义。

3.2 在遗传性疾病诊断中的应用

       已发现的人类遗传性疾病达数千种,主要分为两大类:一是符合孟德尔遗传规律的单基因遗传病和不符合孟德尔遗传规律的多基因遗传病。传统的诊断依据是疾病的表现型病变,而表现型病变容易受外界因素影响,在某种程度上影响诊断的准确性和可靠性;而遗传性疾病的分子诊断则通过分析患者的DNA、RNA、染色体、蛋白质和某些代谢产物来揭示与该遗传病发生相关的基因、基因型、基因的突变、基因的单倍体和染色体核型等生物学标记,与传统疾病诊断方法相比具有更准确可靠和早期诊断的优势,有利于临床医学对遗传性疾病进行早期预防、早期诊断和早期治疗。如分子诊断能够检出家系中的致病基因携带者或高危个体,能在胎儿出生前判断其是否为患者,因此,分子诊断是降低单基因遗传病发病率的根本措施。珠蛋白生成障碍性贫血是一种单基因遗传性溶血性疾病,通过基因技术诊断,发现其基因突变是以点突变为主要表现,并与地域及种族有明显相关。

3.3 在肿瘤诊断中的应用

       肿瘤的发生是受到多因素影响的过程,而基因的异常是其中的原因之一。细胞癌基因是一类普遍存在于正常细胞内调控细胞增殖和分化的管家基因,当受到物理、化学或其他一些环境因素作用时可被激活。癌基因激活的机制十分复杂,包括碱基替换、插入、缺失或重排,导致点突变、移码突变、错译突变、终止密码突变及甲基化程度降低等。肿瘤标志在诊断肿瘤、检测肿瘤复发与转移、判断疗效和预后以及人群普查等方面颇有较大的使用价值。肿瘤标志分为基因型标志和基因表型标志。基因型标志是指基因本身突变和表达异常,能反映癌前启动阶段的变化;基因表型标志是指基因表达产物表达和调控异常,表现为其所编码的表达产物合成紊乱,产生胚胎性抗原、异位蛋白等,一般出现较晚。因此,寻找特异性肿瘤基因型标志进行肿瘤基因诊断,对于肿瘤的早期发现和诊断以及肿瘤的预防和治疗具有至关重要的意义。液相芯片是美国Luminex公司研发的继基因芯片和蛋白芯片之后的新型生物芯片,该芯片高通量、特异性强、准确率高、简单、快速、使用的标本量少,可以检测多个肿瘤标志物,有助于临床发现早期肿瘤。

3.4 其他方面的应用

       分子诊断还被运用到耐药性的分子诊断、疗效监控、卫生防疫等方面。如耐药性的分子诊断主要针对感染性病原体和肿瘤而言。疾病耐药性分子诊断包括通过耐药基因表达改变来分析其耐药性,或通过检测病原体的亚型或突变位点从而分析其耐药性。分子诊断还有一个重要的应用方向是对多基因疾病的易感性判断和诊断,如糖尿病、心血管疾病、自身免疫性疾病等一些由遗传因素和环境因素共同作用所致的疾病。

4、发展趋势与展望

       人类基因组测序计划的完成,随着疾病基因和疾病相关基因的克隆及其功能研究的进展,为分子诊断学带来空前的机遇。一般而言,某一致病基因被发现,几个月即可用于诊断,而疾病相关基因一般也只需一两年即可被用作评估患病风险。疾病基因突变谱,尤其是单核苷酸多态性图谱的建立,为分子诊断提供了强有力的工具。此外,利用基因工程手段还可开发重组疫苗的技术和病原体基因组测序技术等。

       分子诊断的发展趋势:一方面应用现有的DNA分析技术,另一方面利用现有基因功能研究的成果,不断扩大可进行分子诊断的疾病种类,加强疾病的分子机制的研究。不仅表现在DNA水平上阐明疾病的分子缺陷,而且进一步探索疾病在转录和翻译水平发生的分子病理学。

       分子诊断存在的问题,主要在准确性、稳定性和复杂性方面。我国分子诊断技术起步较晚,目前只是零星开展一些项目,未形成规模,也缺乏标准化,质量控制还不够成熟,某些项目检测技术还存在一些障碍,监管体系有一定的局限性等,使得对分子诊断的结果进行比对还有一定的难度。但由于分子诊断的潜力和技术有强大优势,经过不断地发展、更新,分子诊断将在临床上对疾病的早期诊断、疗效监测及预后评估等发挥越来越重要的作用,极大地推动现代临床诊断医学的发展。

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