【独家】白话胶体金系列——第二话<标记>下篇

5）离心纯化：

目的有几方面：去除游离蛋白；置换储存液；浓缩。高速离心，本身是一个加速破坏的过程，所以离心需要平衡两点，“上清干净”和“无不溶颗粒”，这两个矛盾的问题在小量离心时不明显，但是大量离心就讲究了，以下引自涛哥答疑录：

“关于金标记物的离心方法，五花八门，各种各样的都有，比如：有人先低速离心，去掉大颗粒沉淀，再高速离心，去掉上清；有人直接一步离心，去掉上清；有人梯度分步离心，离心三次；有人梯度分步离心，离心两次。具体需要采用哪种离心方法，跟金的质量、 标记物质、体积、颗粒大小都有关系。梯度分步离心，转速是逐步升高的，举个例子：比如一步离心某个金标记物，需要10000rpm 离心2小时才能离心彻底，梯度分步离心可以这么做，6000rpm 离心半小时，分离上清和沉淀，8000rpm 离心半小时，分离上清和沉淀，12000rpm 离心，直至上清清澈，去掉上清，将三次沉淀混合复溶。这么做是为了避免最先离心下来的金标记物，被长时间高速挤压而聚集。”

6）复溶：

很多新人一上来喜欢要配方（这情有可原，因为新手对体系没有概念，不知道各种物质的作用，很难下手），而很多老司机讨厌直接要配方（这也没错，因为做的项目多了，多少都会有针对性的调整，一张配方吃天下是很难的，拿到原料都会先摸一下脾气，再针对性调整，所以从心里抵触那种重配方轻实践的思想）。

我们悬浮金子，首先要保持金标物液态稳定，然后是干燥过程中稳定，然后是干燥后稳定并且充分释放，我在这里从理论上介绍一个基础配方，再简单介绍几个常见的使用物质的添加思路：

我们先看一个基础配方：0.01MTris-HCl Ph8.5+1%BSA+10%蔗糖。

首先是缓冲液：金标物标记的是蛋白，蛋白需要保存在缓冲体系中，所以我们需要一种缓冲基质，而标记中我们讲了Ph对蛋白电荷的影响，虽然已经标记并且封闭了，但是低Ph使蛋白带更多正电荷，仍然会导至金标物交联死金，所以我们需要较高的Ph，这是我们不用7.2的PB的原因；太高的Ph又会使蛋白与金的电荷斥力增大，有脱落的风险，所以Ph又不能太高，最终Ph8.5的Tris缓冲液脱颖而出，大部分单抗的等电点在8.2，8.5这个Ph可以保证标记抗体带少量负电荷维持标记物整体稳定，对于等电点不确定的重组抗原，Tris这个缓冲基质也完全胜任。离子本身对金标物有破坏作用，所以我们用很低的摩尔浓度，更不会主动添加NaCl（需要的话，一般是加在样品垫或者样品缓冲液中）。

然后是BSA： BSA有几个作用，一是高浓度杂蛋白的存在，有利于保护标记蛋白；二是用高浓度BSA封闭金垫，金垫上如果有易吸附蛋白的位点，就让他吸附BSA，从而使金标物能够顺利释放出去；三是流动封闭NC膜，NC膜通过电荷和疏水两种作用，极易吸附金标物，产生层析不干净、T线反白等异常问题，而BSA在层析过程中，一边流动一边对NC膜进行封闭（所谓的流动封闭），可以明显改善这种异常现象；四是BSA可以对蛋白之间的非特异反应起到一定的封闭作用。

最后是糖：糖作为一种干燥保护剂，阻止蛋白在干燥过程中变性（两种假说，代替水化膜保护氢键和结合水，形成玻璃态保持蛋白三维构象），他可以提供一个相对亲水的环境，避免金标物通过疏水作用与金垫牢固结合。所以稳定性（长期或加速）出现金子不释放的情况，多半是没有加糖，金子上蛋白与金垫发生了牢固吸附导至的。另外金子吸潮后也会出现释放困难的问题，而糖加多了对湿度更敏感，所以一般加10-20%。

这是一个基础配方，组成的思路就是这样，基本上可以通用了。我们搞配方，不是打网游，基础不等于白字装备，而动辄7、8个、十几个成分的配方也等于牛逼的橙色史诗装备，他一般都是特事特行，根据需要调出来的，是一个无奈的产物，正常的配方就应该宜简不宜繁，越简单适用性越广，越容易控制，出问题也越容易分析。

下面简单介绍一下其他添加其他物质，比如：

表面活性剂（吐温）：促进释放的作用，但是物理吸附中疏水作用占很大比例，在液相中如果表活浓度过高，金标蛋白有脱落风险。另外，有吐温的存在，干燥后吸潮的风险大大增加，对环境湿度的要求更高。所以还是尽量少加，而且含表活的金标物尽量不要液态长时间存放。

高分子聚合物（PVP、PEG）：本身对释放有一定的促进作用，而且可以促进反应，但是引起非特异性反应的风险也较高。另外加在金垫中，在干燥过程中会迫使金标蛋白相互聚合，从而形成大的颗粒，正面作用是提高了灵敏度，负面作用是容易出假阳，而且在某些时候引起颗粒过大，在NC膜底部会出现不能顺利层析的颗粒物。

酪蛋白：在某些情况下，有促进金子释放的作用，一般用不到。另外对蛋白间的非特异反应有很强的封闭作用，但是其本身对正常的免疫反应的封闭作用也很强，所以视情况而加。

海藻糖：对蛋白的保护作用强于蔗糖，成本相对较高，如果金子稳定性有问题，尤其是加速稳定性出问题，可以再加点海藻糖。

7）金垫：

材质常用的有几种，包括玻纤、聚酯和无纺布。没有谁好谁不好的说法，主要选择依据是均一性，其他的根据自身需要来选择，比如厚度、承载量、释放速度（一般聚酯的释放速度快于玻纤）等。不同材质、型号的金垫，有些可能需要前处理，如果能够正常铺金、正常释放，一般直接用也没啥大问题。

4.质量检验：

检验成功标记的方法只有组装成品，进行性能测试这一种方法。

除了死金等异常外，常见的失效模式有两种，一是没有标记上（废话），二是标记后没有活性或者活性不达标，这两点通过性能检测一步到位。

通常文献中介绍的分光光度计扫描法，会有最大吸收峰右移的现象，这只能说明标记上了东西（粒径增大），但是即使没标记上目标原料，BSA的封闭也会稍微增大粒径的，况且成功标记上原料，性能不达标也是白瞎，所以这个不能用作金标物的质量检验。

但是分光光度法扫描也不是没有用处，可以用作控制复溶比例（金标物浓度）的一个指标。而且引申一下，最大吸收峰右移现象，可以帮助我们分析标记物没活性的原因（对比正常的标记结果，看右移现象及程度，可以知道这个失效是没标记上，还是标记了但没活性。这一点是我的猜测，没实际用过，因为物理吸附很少出现这种情况，而共价标记中buffer选择不合适，标记不上的现象会很常见，测粒径变化可以帮助我们分析标记结果）。