（一）基本概念 为了方便新人与老司机交流，需要掌握一些基本名词和概念，以便准确的表述问题。这些知识不考试，写作时间也有限，关键还没有稿费，所以随便写写，没有咬文嚼字，如果意思表达错了请指正，形式上就不用对着教科书抠字眼了，谢谢。 1.抗原、抗体，和二抗： 抗原（半抗原）：能够诱导产生抗体（免疫原性）并且和这个抗体特异性结合（抗原性）的物质，一般称为大分子物质。半抗原是只有抗原性，而不能诱导产生抗体的物质，称小分子物质，通常只有一个抗原决定簇。一般低于10KD免疫原性就很差了，但免疫原性与分子量没有绝对关系，还要看结构的。 抗体：能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白。单抗和多抗，单抗是针对一个抗原决定簇的，单一类型的抗体；多抗是针对同一免疫原（一个或多个抗原决定簇）的不同单抗的混合体。种类上又分IgG、IgM等，IgG又分不同亚型，1、2a、2b等。结构上是Y型，上面两个相同的可变区Fab与抗原特异性反应，恒定区Fc具有种属特异性。 二抗：以抗体（通常只是Fc片段）免疫另一物种产生的一种抗体，有多抗比如羊抗鼠IgG（Goat anti mouse IgG），是用鼠IgG的Fc片段免疫山羊，获得的一种多抗，不管你小鼠单抗是针对什么抗原的IgG（主要是Fab差异），其Fc基本是相同的，所以都能被羊抗鼠IgG结合，常用做C线，但是不同亚型的IgG的Fc段结构有差异（分型的基础），与二抗的结合效果可能存在区别。也有单抗如鼠抗人IgG、鼠抗人IgM，最常用的间接法（捕获法）的原料。 虽然我们常用羊抗鼠IgG做C线，但是请注意C线≠二抗，C线用什么就说什么最省事，不要把C线如何如何，说成二抗如何如何，这样会让大家误解你的检测模式设计。 2.检测模式：（如图，手机上看不到，试试电脑版浏览，如果还看不到就得留言联系管理员了） 1）夹心法：  2）间接法（固相包被抗原，标记抗人抗体）和捕获法（固相包被抗人抗体，标记抗原），其实我觉得没必要刻意纠结这两个名词，反正交流的时候，都免不了被问标记的什么，包被的什么。这两种方式相当于一个另类的夹心法，调整起来跟夹心法基本想同。  3）竞争法：一切与夹心法反着来。如下图，人为偏向标记抗体和待测抗原先反应，即正常的不公平竞争模式，有利于消线；还有标记抗原，NC包被抗体的，这样标记抗原和待测抗原在同一时间与T线抗体竞争结合，是一种公平竞争，灵敏度比前者要差很多。  4）标记抗原还有个搭桥法： 在制作重组抗原的时候，人为嵌入一段便签序列，这样做一方面有利于抗原纯化；另一方面可以简化并且高效标记。因为结构原因，抗原标记相比抗体标记，一是容易引起交联死金，不好顺利标记；二是容易掩盖活性位点，不能有效标记。这时候标签就能发挥很大作用了，比如你抗原有GST标签，你可以先在金子上标记抗GST抗体，然后再加进去抗原，形成“金--抗GST抗体--（GST标签）抗原”这种复合物，相当稳定，而且抗原远离金子不会形成空间位阻，并且你标记一个GST抗体，所有含GST标签的抗原都可以拿来搭桥。 3.空间位阻： 就是胶体金颗粒在空间上阻挡了抗体和抗原的接触和反应，说几个数据会比较形象：金子常用大小为40nm，IgG抗体一般分子量在160KDa左右，长度约8nm，并且因为抗体的结构原因，一般是Fc结合胶体金，Fab向外伸展，反应部位充分暴露，不存在空间位阻的问题。但是标记重组抗原就不同了，在金标上常用的重组抗原一般15-40Kd，换算过来相当于0.8-2nm左右，并且标记结合部位很随机，不像抗体那样天然的远离反应位点，所以标记时有两种情况会导至没有活性，一是直接标记在反应位点上，；二是标记位置非常靠近反应位点，虽然没有掩盖，但是因为金子的空间阻挡，抗体还是没法跟他反应。  4.一些文献常用词： 金标试纸条一般是两条线，质控线（C线，Control line），检测线（T线，Test line，这里的抗体一般称呼是coating / capture antibody），金结合垫（conjugate pad，这里的抗体一般叫labeling / detection antibody）。  5.蛋白等电点PI： 蛋白质（氨基酸）是一种两性电解质，既可以从羧基释放H+，从而带负电，也可以让氨基结合H+而带正电，到底带什么电荷取决于所处Ph环境，Ph等于等电点时整体电荷为0（等电点时单个氨基酸理论上有不带电荷的可能，但是由不同氨基酸组成的蛋白质，应该是带电荷的，只是所带正负电荷数相等），大于等电点时整体带负电（负电荷总数多于正电荷），小于等电点时整体带正电（正电荷总数多于负电荷）。 也就是说在任何Ph环境下，蛋白质都同时带正电荷和负电荷，电荷在标记过程中起着很重要的作用，一是其本身贡献结合作用力，另一个重要的影响是，标记的前提是蛋白和金在溶液中接触，而电荷直接影响两者的接触，也就是影响标记效率。还有一个隐藏的属性是，加入蛋白本身对标记Ph有一定的影响（释放或结合H+），而且其保存液也是一种缓冲液，这个隐藏属性对标记环境有一定的影响，尤其是放大标记过程。  6.结合的三种作用力： 1）电荷引力： 前面讲过，胶体金表面有一圈负电层，蛋白质在标记环境下有一些基团是带正电荷的，两者之间通过电荷引力结合。注意，蛋白虽然是通过正电荷与金结合，但是我们调节Ph的目的并不是刻意使蛋白带正电，如果一个蛋白带有很多正电基团，这些基团同时吸引结合多个胶体金，这些胶体金再去结合带正电的蛋白，再结合胶体金……，这样循环下去，就会形成交联死金的情况，表现就是低Ph条件标记，胶体金变紫、变蓝甚至变黑沉淀。相反我们的目的是使蛋白带合适的负电荷，不至于与胶体金无限交联，但是这个Ph也不能太高，太高了蛋白本身正电基团减少，蛋白与胶体金负电斥力增加，两者很难接触到一起，表现就是随着Ph的继续升高，标记物活性降低，（极端情况下，蛋白负电荷太多，与金完全相斥，不发生结合）。 因此Ph需要在一个合适的范围，有合适的负电基团保持与胶体金的斥力，维持稳定，同时有足够多的正电基团与胶体金吸引并结合，保证高的标记效率。 2）疏水作用力： 这种力在免疫反应中的作用最大最强，对于维系复合物稳定起到主要作用，而胶体金与蛋白的稳定吸附也很依赖疏水作用力，如果说之前的电荷引力是相亲，第一眼的印象很重要（同性相斥，异性相吸），那么疏水作用力就是领证，维系稳定的婚姻关系（强力、长期），所以对于标记来说，除了Ph外，表活的存在也会严重影响标记效率，因此标记时不能加表活，烧金、标记的玻璃器皿也最好别用含表活的洗涤灵清洗。 早期论坛里有一种说法，说调Ph到等电点附近时，折叠在蛋白内部的疏水基团会暴露出来，增加与金的疏水结合。这个说法我没找到相关的文献支持，说说我的理解： 论坛这个说法可能是源于蛋白盐析和等电点沉淀法的原理，蛋白质一般在等电点时溶解度最低，在等电点外的Ph环境下，因为蛋白上面带同种电荷相斥和水化膜的保护，能够稳定溶解，但在等电点时蛋白的净电荷为0，斥力消失，蛋白容易碰撞到一起，因疏水残基互相结合而析出，如果再加入盐蓄意破坏水化膜，蛋白就稀里哗啦的沉淀了。但这些疏水基团并不是在等电点时才由内部露出来的，虽然蛋白的大部分疏水基团折叠在内部，但是仍然有疏水基暴露在水中（数量不一，多的据说有约1/3），也就是在等电点时，没有了斥力，蛋白表面的疏水残基容易发挥作用，而不是在等电点时才暴露出疏水基团。 从这里引出的另一点推论是，疏水作用力的发生需要疏水基团空间上足够靠近，如果有静电斥力存在，疏水基团碰不到一起，也就发挥不了作用了，这也就是说，标记时Ph过高导至活性降低的原因，一是正电基团减少，电荷引力减弱，另一个静电斥力太大，疏水作用力很难发挥作用，综合结果就是结合到金子上的蛋白更少了。 最后要说的是，蛋白的折叠结构确实会受Ph的影响，因为蛋白质的COO-和NH3+这两种残基之间会形成电荷引力，这是维持蛋白三维空间构象的一种作用力，不同的Ph条件，会改变蛋白的电离倾向，从而破坏这种作用力，使蛋白质的空间构象发生一定的改变。这种改变带来什么影响不好说，我们常用的Ph范围内，抗体构象改变的程度应该并不大。  3）金硫键：一个强大的作用力，以下引自涛哥的《桔林杂谈（3）—纠结的PI+0.5》。 “为什么我们在实际探索最佳标记PH的时候，有的蛋白最佳标记PH并不符合这个规律？有的蛋白随着标记PH的升高反而表现出更强的特异性反应，或者特异性反应强度出现抛物线样的变化，或者······ 我们在解释PI+0.5时，并没有引入配价结合参与标记过程的机理。蛋白的半胱氨酸残基可以通过硫基与胶体金表面形成配位键，而这种结合作用力是非常强的，完全可以打乱上述规律。比如一个蛋白的氨基酸序列中含有相对较多的半胱氨酸残基，而这些残基分布在序列的多个位置上，牢固的吸附于胶体金表面，这样蛋白的特异性表位可能很难暴露出来。如果采用较高的标记PH，当斥力占绝对优势时，蛋白特异性表位将会暴露出来。反应在表观上，就是在一定范围内，标记PH越高，特异性反应越强。如果一个蛋白含有非常多的半胱氨酸残基，由于强大的配位键结合力，将会导至金标记物互相吸附，进而凝集、蓝变甚至沉淀。这可以解释，为什么有的抗原纯度虽然很高，也不含有干扰成分，但即使采用很高的标记PH，也无法标记成功。将抗原加入胶体金溶液中，即发生蓝变。 另外一个典型的可以说明配位键对标记效果影响的例子是：硫柳汞，这也是胶体金产品中忌讳该防腐剂的原因。 此时，我们会发现配价结合作用力与其它作用力对标记效果的影响，有时候会产生矛盾，而互相矛盾的作用力共同作用一个反应的时候，可能会出现抛物线样的性能表象。在抛物线的前后位置，代表了某种作用力更占优势，而在抛物线的顶端，是各种作用力的平衡点。 在查阅文献资料的时候，我们还可能会看到一种说法，关于标记蛋白大致可以分为三类：PH非依赖型、PH非严格依赖型、PH严格依赖型。之所以有这种说法、出现这些现象，与三种作用力的共同作用有关。对于PH非依赖型和非严格依赖型往往与蛋白的氨基酸序列中含有相对较多的硫键有关。“ 未完待续…… |
wangmin121612 发表于 2017-2-22
3）分别加入10ug待标记原料，混匀，反应30min，观察颜色变化。（标记时间后续需要优化，分析颜色变化有利于 ...
wangmin121612 发表于 2017-2-22
3）分别加入10ug待标记原料，混匀，反应30min，观察颜色变化。（标记时间后续需要优化，分析颜色变化有利于 ...
numbrg 发表于 2017-2-24
加入蛋白或者封闭后，最好的状态是仍然保持红色，但是颜色稍微有一点加深的感觉，这代表标记上了，且没有 ...
羊抗鼠IgG做C线，但是请注意C线≠二抗，C线用什么就说什么最省事，不要把C线如何如何，说成二抗如何如何，这样会让大家误解你的检测模式设计。
Brain 发表于 2019-2-20
@numbrg，标记好的胶体金一般是怎么添加到结合垫上的呢？涂or喷上去的。
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好东西呢
