血流感染分子诊断的研究进展

血流感染(blood stream infection)是一种严重的全身感染性疾病,其中仅有30%~40%的血流感染者可以通过培养的方式发现致病菌[ 1, 2]。引起血流感染的微生物包括细菌、真菌、病毒及寄生虫,阳性血培养可为临床提供病原学诊断的依据。血流感染初期的24 h内,若未能及时进行早期诊断以及合理的抗菌药物治疗将会导至患者存活率大大下降[ 3]。

虽然血培养仍然是目前诊断细菌性血流感染的金标准,但血培养的阳性检出率不高,检测时间过长(阳性报警需要1~5 d,甚至更长),无法满足临床早期、快速诊断以指导治疗的需要。同时也不适合临床实验室对不易培养的微生物的及时检出,如军团菌属( Legionella spp.)、巴尔通氏体属( Bartonella spp.)和曲霉属真菌( Aspergillus spp.)等[ 1]。分子生物学检测技术的发展旨在增加病原体检测的敏感性和特异性,扩大检测的病原谱,缩短检测时间,减少抗菌药物对病原体检测的抑制作用[ 2, 3]。理想的分子生物学方法可通过分析患者的血液标本,快速提供准确的细菌、真菌或病毒感染信息,甚至提供常见致病菌的耐药基因检测结果,指导临床医生及时、准确地使用抗菌药物进行抗感染治疗。更为理想化的结果是对全血标本检测的同时提供感染细菌的定量等数据,用于评估微生物治疗后的血液清除率。

当前,应用于临床实验室血流感染检测的分子生物学技术主要包括基于病原微生物DNA或RNA的检测技术如核酸杂交(nucleic acid hybridization)、核酸扩增及DNA序列分析、基因芯片和以蛋白质组学为基础的质谱检测技术等。

一、核酸杂交技术

核酸杂交是指具有一定互补序列的2条核酸单链在液相或固相体系中按碱基互补配对原则形成同源或异源双链分子的过程。核酸杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的2条单链之间进行。其中,荧光原位杂交技术应用于临床实验室鉴定工作已有10余年,其检测的敏感性和特异性可达到96%~100%[ 4]。在第1代荧光原位杂交技术(peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization, PNA-FISH)的基础上[ 5, 6],第2代荧光原位杂交技术(quick- fluorescent in situ hybridization, Quick-FISH)已能更好地满足临床实验室对操作简便、快速的需求[ 4]。不同于美国研发的第1代PNA-FISH (AdvanDX,MA,美国)检测技术,Quick-FISH省去了杂交后的30 min清洗环节,采用了“自我报告”探针,同时将杂交时间节省到了15 min。这将大大提高对血培养阳性的革兰阴性细菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌,以及革兰阳性细菌如金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌的检测效率,同时简便的操作也将更有利于该技术的推广。

Deck等[ 4]在Quick-FISH的基础上,使用葡萄球菌快速检测技术( Staphylococcus Quick-FISH)可以在30 min内快速鉴定金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌,其检测敏感性达到99.5%和98.8%。Quick-FISH检测技术与聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR)联合使用时优势更加明显[ 7],如检测阳性标本中金黄色葡萄球菌的 mecA基因、耐万古霉素基因 vanA和 vanB等,快速诊断提供合理用药的重要提示对患者的预后有重要意义。

二、核酸扩增及DNA序列分析

PCR是一种体外核酸扩增技术。目前,PCR已成为分子生物学及其相关领域的经典试验方法,由PCR演变的相关核酸扩增技术也逐步在临床微生物学检验领域得到应用。PCR在血流感染微生物检测和鉴定中的应用体现在3个方面:一是对分纯的病原菌鉴定;二是对血培养阳性培养物快速鉴定;三是对临床标本中难以培养病原菌进行检测和鉴定。可通过2种方式检测和鉴定病原微生物,一是使用特异引物扩增检测病原微生物目标基因[ 8];二是使用通用引物扩增检测细菌16 S rRNA和真菌 ITS及5 .8 S、26 S rRNA等基因D1/D2序列,同时进行测序分析[ 9, 10, 11, 12]。

检测特异性目标基因需要合成相关病原微生物的特异性引物或购买有关试剂盒,核酸扩增反应体系条件不尽相同。Sidor等[ 8]研究发现,对布鲁菌 bcsp31基因设计特异性引物,可以通过PCR的方式快速检测血液、组织等标本中的布鲁菌,敏感性和特异性分别达到70.4%和98.3%。

Springer等[ 9]通过PCR的方法检测了803例侵袭性曲霉病患者的全血和血清标本中的曲霉菌 ITS1 -5 .8 S rRNA后发现,全血标本中曲霉菌检测阳性率可达到85%,略好于血清标本的79%。使用通用引物扩增检测细菌16 S rRNA基因,再进行基因序列测定、计算机分析和比对,最终鉴定病原微生物,其核酸扩增反应体系条件较易掌控,应用范围广,可以发现新的菌种。Karah等[ 10]对2005至2007年挪威的113例不动杆菌属血流感染患者研究发现,使用PCR方法可以快速检测血培养阳性瓶中的鲍曼不动杆菌等。对于碳青霉烯类常见的耐药突变基因 bla OXA-51 -like进行测序,有助于早期报告耐药菌以提示临床合理用药。对全麻拔牙患者的血流感染风险研究显示,使用通用引物检测全血标本中的16 S rRNA,结合焦磷酸测序技术可以很好的发现草绿色链球菌等,对于评估血流感染有重要意义[ 11]。Jeng等[ 12]在对血流感染病例的研究中发现,使用高分辨率熔解曲线分析(high-resolution melt analysis,HRMA) PCR检测沙门菌的16 S rRNA可有效地检出致病菌。

由德国公司开发的SepsiTestTM 检测试剂盒,采用3对引物特异性地扩增全血标本中致病菌的16 S rRNA、18 S rRNA序列,通过测序后在线BLAST比对便可以准确地鉴定血流感染致病菌。随着测序技术的不断发展和16 S rRNA数据库的不断完善,基于细菌16 S rRNA基因的PCR扩增与测序分析在临床细菌分类和鉴定中的应用会越来越广,尤其在临床少见菌、苛养菌以及固体培养基不生长细菌的鉴定、检测和新菌种发现方面具有独特优势。

三、实时荧光PCR测定

实时荧光PCR对于传统PCR技术进行的改进是为了提高PCR的敏感性、特异性和检测速度以及避免污染。实时系统提供了一个封闭的环境,运用荧光共振散射转移探针、分子信标或TaqMan探针(Roche molecular systems)检测扩增产物[ 13, 14, 15]。分子信标探针是单股探针,内部有识别序列,当该分子信标探针与含核酸补充序列PCR产物接触,探针即打开与PCR产物结合,其内所含的报告基团释放荧光指示剂,即可产生可测量的荧光信号。随着PCR反应的进行,荧光信号不断累积。

目前,实时荧光PCR已经广泛应用于血液中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)等病毒检测,在血流感染致病菌检测方面新产品不断被开发推广[ 15, 16, 17]。其中,罗氏公司产品Light Cycler® SeptiFast (LCSF) Test (Roche molecular systems, 瑞士)可在6 h内直接检测覆盖90%血流感染常见致病菌的25种细菌或真菌[ 1]。该试剂盒可检测的致病菌包括革兰阴性细菌(大肠埃希菌、克雷伯菌属、黏质沙雷菌、奇异变形杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等)、革兰阳性细菌(金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌等)和真菌(白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌等)。虽然该产品的检测敏感性可以达到300 cfu/mL,且不受血液中PCR抑制物干扰,但由于仪器、试剂费用昂贵,临床广泛应用较为困难。

特异性扩增致病菌的16 S rRNA结合实时荧光PCR检测平台,可以更加高效、准确地检测血流感染致病菌,甚至可以对常见耐药基因 mecA、 vanA、 vanB、 vanC1和 vanC2 /C3进行有效地检测[ 13, 14, 18]。Steindor等[ 13]对511份血培养阳性瓶的病原菌检测结果显示,16S rRNA结合实时荧光PCR对革兰阴性和阳性细菌的检测敏感性分别为96.1%和89.9%,可有效检测92.9%病原菌中的 mecA基因。整个检测结果的获得,仅需要在血培养阳性后的4 h内完成。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的快速检测对临床准确合理用药很关键,使用Prove-itTM Bone & Joint assay检测系统可以及时准确地分析血流感染细菌的耐药性,指导临床有效治疗[ 16, 19]。韩国研发的血流感染致病菌检测试剂盒实时荧光PCR TaqMan assay (M&D, Wonju, 韩国),可以准确、快速地检测出血流感染的革兰阳性、阴性细菌和部分真菌,总体检测的敏感性在试剂应用时可以达到99.6%[ 20]。

四、基因芯片(gene chip)

基因芯片也称DNA微阵列(DNA microarray),可分固相基因芯片和液相基因芯片。基因芯片检测基本原理是将已知的核酸片段固定在一定的固相支持物表面制成核酸探针,利用碱基互补原理,使其与待测DNA标本进行杂交反应,从而获得需要的生物学信息。与传统的核酸印迹杂交方法相比,基因芯片检测技术具有高通量、多参数同步分析、快速全自动分析、高精确度和高敏感性分析等显著特征。液相基因芯片是近年来发展出的一种新的芯片技术,与固相芯片相比,液相芯片在反应动力学、反应速度、检测敏感性、稳定性以及自动化程度方面都有较大的优越性。

目前,检测病原体的芯片技术对靶基因的选择有2种策略:一种是选择细菌的核糖体基因(如16 S rRNA),另一种是选择细菌的“特异基因”。基因芯片也可用于病原微生物耐药基因的表达谱检测、突变分析等。目前,商品化基因芯片血流感染病原体检测均应用于阳性血培养物,芬兰Prove-itTM Sepsis assay (Mobidiag,芬兰)通过多重PCR和杂交的方式,可在3.5 h内鉴定19种革兰阴性菌,15种革兰阳性菌,8种真菌和 mecA、 vanA、 vanB耐药基因,敏感性和特异性分别达到94.0%和98.0%[ 1]。法国生物梅里埃公司新收购的Film Array BCID Panel 则在1 h左右可检测包括 mecA、 vanA、 vanB、 kpc耐药基因及革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌在内的27种病原菌。

Samuel等[ 21]使用Gram-Positive Blood Culture (BC-GP) assay试剂盒 (Nanosphere Inc., Northbrook, IL)对203例革兰阳性菌血流感染的患者进行检测,发现12 h内可以获得12种不同的葡萄球菌属、链球菌属和肠球菌属细菌的检测结果。对耐药致病菌的耐药基因检测结果显示, mecA、 vanA/B基因的检测阳性率分别可以达到92%和100%。芯片技术快速、高通量、灵敏的优势使其具有极大的应用前景。

五、质谱技术

除了基因分析,蛋白组学作为一种日益重要的技术已应用于病原微生物的鉴定和分型分析。近年来,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time off light mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术在细菌和真菌等微生物鉴定中的应用受到广泛关注[ 22]。质谱技术主要是利用特定离子源将待测标本转变为运动的离子,这些离子根据质量/电荷比的不同,在电场或磁场作用下得到分离,并用检测器记录各种离子的相对强度,形成质谱图,通过与已知数据库进行匹配,匹配率最高的为未知微生物的鉴定结果。它具有高敏感性、高通量和快速的特点,但由于其对未知微生物的鉴定是通过所获得的质谱图与已知数据库进行匹配分析来实现的,不同的标本制备方法对获得的待测标本质谱信息有明显影响,而相关数据库的构成和质量则影响鉴定的准确性。

由日本岛津公司发明的MALDI-TOF在2002年获得了诺贝尔奖。VITEK MS 快速微生物质谱鉴定系统由电脑和MALDI-TOF两部分组成。VITEK MS开启了微生物研究新时代,将质谱技术实现于临床细菌检测和鉴定的常规分析,可同时检测192个标本,大大提高了检测效率。2007年,布鲁克公司推出的MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统可以满足微生物的快速鉴定与分类的需求。该系统包括MALDI-TOF MS仪和Biotyper数据库,具有快速、简便的工作流程和强大、可靠的数据处理能力,是微生物鉴别与分类中的最新技术。目前数据库中已经含有常见的近4 000种微生物的特征指纹图谱,而且还在不断增加中。此外,用户可以根据自己的需要,轻松地添加所获得的新的微生物特征指纹图谱,并用于日常检测、鉴定工作中。从临床实验室纯分的微生物单菌落鉴定到血培养阳性瓶培养物中病原微生物鉴定,MALDI-TOF MS的应用均有许多报道。最近已有临床实验室尝试用MALDI-TOF MS检测碳青霉烯类耐药基因和超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta lactamases,ESBLs)的活性。

一种新型的多聚合酶链反应藕联电喷质谱电离技术( eectrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)荣获了2009年美国科技金奖,该技术能够通过快速、高通量、精确的数字分析,检测和鉴定临床及环境中分离的菌株或标本中的病原微生物,并能定量鉴定对人和动物致病的病原微生物。该技术鉴定病原微生物快速、准确、敏感性好、特异性高,通常不需要测序,更适用于预先无法确定病原方向的突发疫情和不明原因感染的诊断。该技术从标本中制备核酸,选择特异性的核苷酸引物进行多重PCR扩增,之后对扩增产物进行全自动的ESI-MS分析检测,质谱仪可对扩增产物进行准确至碱基组成的精确定量,所获数据与经校准过的已知微生物标准数据库进行比对,便可确定所检测病原微生物的种类。Schubert等[ 22]对MALDI-TOF MS检测标本制备进行了一定的改进,更加准确、快速地用于直接检测血培养阳性标本。Jeng等[ 23]在比较研究PCR-HRMA(PCR coupled to high resolution melting curve analysis)检测技术和PCR- ESI-MS方法时发现,两者在检测致病菌的敏感性均能达到90.0%以上,PCR-ESI-MS的特异性能达到98.5%[ 24],但是PCR- ESI-MS可以有效地检测多种致病菌混合感染的标本。与MALDI-TOF-MS比较,在菌属和菌种水平正确率PCR-ESI-MS均高于MALDT-TOF-MS[ 24, 25],在血培养阳性细菌的鉴定能力和速度上2种技术无明显差别,均显示了快速、准确的优势。在培养阴性或难培养的致病菌检测方面,PCR-ESI-MS能够诊断并定量。然而,该技术极其昂贵的仪器和封闭试剂成为在发展中国家甚至欧美国家临床实验室应用最大的瓶颈。

六、GeneXpert分枝杆菌检测平台

随着获得性免疫缺陷综合征和结核病疫情的日益严重,在临床发现的分枝杆菌血流感染病例越来越多,已经成为临床诊断、治疗的一个难点,早期诊断的需求异常紧迫[ 26]。结核分枝杆菌生长缓慢,其快速、准确的检测和耐药性分析越来越成为实验室进行结核诊断的重点。美国Cepheid公司开发的Xpert MTB/RIF assay试剂盒适用于GeneXpert仪器,可以在2 h内直接从患者痰液中检测结核分枝杆菌及其对利福平的耐药性。整个检测过程都在密闭环境中进行,手动操作时间短(不超过5 min),对操作者和周围环境安全。

Feasey等[ 26]在GeneXpert MTB/RIF assay检测仪器的基础上,对血流感染的分枝杆菌进行了研究。对44例痰培养分枝杆菌阳性患者的血液标本检测阳性率为21%,2周后血液标本检测阳性的患者死亡率显著高于阴性患者。Banada等[ 27]对GeneXpert MTB/RIF检测系统检测分枝杆菌能力做了进一步的评估,使用卡介苗作为模式菌,在血液标本中进行检测,细菌浓度分别为10、5、1和 0.25 cfu/mL时,检测的敏感性分别达到100%、100%、83%和57%,而同样浓度的细菌在1 mL血液标本的检测敏感性只能达到100%、66%、18%和18%。研究发现血液标本中往往能检测到MicroRNAs (miRNAs),这也是分枝杆菌感染的重要检测标志物。对于活动性肺结核患者的血液标本研究发现,与疾病相关的miRNA-29a可能作为区分结核感染和健康人群的特异性指标,对于诊断活动性肺结核具有重要意义[ 28]。这也必将为分枝杆菌,甚至苛养菌、少见菌等难培养细菌的血流感染提供了一个新的发展思路。

随着对微生物基因组学和蛋白质组学了解的深入,相信在不远的将来,人们能够快速、准确地对血流感染病原体同步进行检测、鉴定及药物敏感性测定,分子技术将成为血流感染诊治必不可少的重要工具。多种检测技术的联合应用,对血流感染病原菌的快速检测以及常见耐药基因的快速检测,必将能实现在较短的时间内(1 d,甚至数小时)为临床实验室提供可靠的血流感染诊断结果,有效地提示临床合理用药、及时诊治,有效提高血流感染患者的生存率。

来源：《检验医学》杂志  作者：上海市东方医院南院医学检验科 郭建综述, 吴文娟审校