高通量测序技术在无创产前检测中的应用

染色体非整倍体是胎儿出生缺陷最常见病因之一，其中以21-三体综合征、18-三体综合征最为常见，占所有足月妊娠的0.2%~0.3%。对先天性遗传病进行产前筛查和产前诊断是优生优育的重要保证。自1970年以来，针对上述胎儿染色体疾病的产前筛查和产前诊断已逐渐应用到临床上，并在降低出生缺陷方面得到了良好的效果。

从取材方法进行分类，产前检查分为有创性和无创性两种。有创性产前诊断是目前诊断胎儿染色体疾病的的金标准，主要是指通过绒毛活检术、羊水穿刺术和脐静脉穿刺术采集胎儿细胞或组织，进行细胞核型分析获取胎儿染色体信息，有创检测的准确率为98%~99%，但伴有0.5%~1.0%的流产风险，同时也会伴有羊水渗漏、宫内感染等风险。因此，有创产前诊断目前仅应用于筛查高风险、高龄妊娠或家庭中生育过遗传病患儿等情况。传统的无创性产前检查主要有超声检查和孕妇血清学检测等方法，使用这些方法进行检测可避免对胎儿和孕妇造成的危害，但是其灵敏度及特异性有限。近20年来，基于超声检查和孕妇各种蛋白或激素的血清学筛查相结合的产前筛查发展迅速。产前母体血清学筛查的目标疾病是21、18-三体综合征和神经管缺陷，当假阳性率控制在5%时，在早孕期、中孕期、早中孕期的检出率分别为82%~87%、81%、94%~96%，这些方法的假阳性率较高，为后续有创性产前诊断带来较大的临床压力与实验室压力。

常规产前筛查和有创性产前诊断方法的局限性促使研究者积极开发一种针对胎儿染色体非整倍体及其他染色体异常的、无创伤性的高精度检测方法。1997年Lo等通过孕育男性胎儿的孕妇外周血血浆Y染色体PCR扩增的方法证明了孕妇外周血循环中存在胎儿游离DNA (cell free fetal DNA，cffDNA)，开启了基于cffDNA无创产前检测(non-invasiveprenatal testing，NIPT)方法。其后，利用各种分子诊断技术对cffDNA的检测已经在胎儿性别鉴定、Rh血型鉴定、X连锁隐性遗传病、先天性多囊肾检测等方面得到应用，但由于方法繁琐、耗费时间长、精度低、费用较高等问题，一直难以推广于临床。

近年来，随着以高通量、自动化为显著特征的二代测序技术的发展，基于该技术的NIPT在临床上迅速得以应用。今年，国家卫生计生委妇幼司发布了第一批高通量测序技术临床应用试点单位，同时发布了《高通量基因测序产前筛查与诊断技术规范(试行)》。如何充分理解并合理规范应用NIPT，如何正确解读技术规范，将NIPT作为常规产前筛查方法时有哪些注意事项，我国产前筛查和产前诊断体系中NIPT该如何正确定位等，本文将对这些问题进行深入探讨。

1母血中胎儿游离DNA的特性

大量研究发现，cffDNA来源于凋亡的胎儿滋养层细胞，经过胎盘屏障时受母体免疫攻击破裂或胎盘细胞凋亡进入母血，自然降解成DNA片段。绝大部分的cffDNA都是包裹在核小体外部，与胎儿游离RNA(cell free fetalRNA，cffRNA)相比，其在外周血浆中的性质更加稳定。早期研究认为，cffDNA在早、晚孕期分别占孕妇外周血总DNA的3%、6%，不同孕妇间个体差异性较大，其中80%的片段长度<193bp，最早可从孕4周时检出，且在7周时稳定存在，随孕周延长而增加。最近研究发现，cffDNA在早、中、晚孕期时含量分别为9.7%、9.0%、20%，分娩后母体cffDNA快速降解，2h内快速消失，半衰期为16.3min，再次妊娠cffDNA的检测不受上次妊娠影响。

孕妇外周血中cffDNA微量存在、非整倍体检测过度依赖于特定基因位点等特点，严重限制了使用常规分子生物学方法检测胎儿染色体非整倍体的技术可靠性和使用范围，迫切需要一种快速、高精度、可自动化的方法。新一代高通量测序方法的出现，可轻易实现同时针对百万以上单分子多拷贝PCR克隆阵列的检测，该方法对游离DNA的研究已经成功应用到无创产前检测、癌症和器官移植标志物研究等方面。

2基于高通量测序技术的NIPT

2008年Lo和Quake两个小组开创性地使用第二代高通量测序技术，对孕妇外周血浆进行测序，成功检测出21-三体综合征(trisomy21，T21)胎儿，后续研究表明该方法的敏感性仅受限于测序序列的数据量，其分析的原理是胎儿为T21时，胎儿的21号染色体2个拷贝数变成了3个拷贝数，从孕妇外周血游离DNA中检出的21号染色体来源的序列(包括T21胎儿和正常孕妇)占整个基因组的比例较胎儿为21号染色体2个拷贝数时升高。

大量的科研小组对该方法的临床应用进行了验证，并使得该方法逐渐成为新的无创检测染色体非整倍体的方法。Chiu等研究753例筛查高风险孕妇，其中86例T21胎儿，结果表明，该方法针对T21胎儿有100%的检测灵敏度和97.9%的特异度，紧接着Ehrich和Sehnert两个小组通过类似的方法证明了该方法的高灵敏度和特异度。Bianchi等对532个样本进行了分析，与其他研究不同的是，此研究对包括易位型三体、嵌合体及复杂变异在内的胎儿非整倍体进行检测，发现13、18、21、X、Y五大染色体非整倍体的检测灵敏度为78.6%~100%，特异度为99.8%~100%，并发现某个染色体为非整倍体时并不影响其他染色体整倍体状态的分析。

针对18-三体综合征(trisomy18，T18)和13-三体综合征(trisomy 13，T13)的检测，Chen等研究小组使用改进后的算法分析发现T13、T18的灵敏度提高到98.9%和91.9%。Palomaki等后续研究亦使用类似方法，对T18和T13的检出率分别为100.0%和91.7%，假阳性率分别为0.28%和0.97%;对283个染色体非整倍体异常样本复合检出率为98.9%，总的假阳性率仅0.5%。

近期，北京协和医院完成的一项以低危为主的孕妇人群进行游离胎儿DNA检测的研究，有效样本1741例，准确检出其中的15例染色体非整倍体样本：8例T21，3例T18，1例T13，2例45X，和1例XXY，结果现在该技术对21、18、13号染色体非整倍体的检测灵敏度100%，特异度99.94%，发现2例假阳性(1例T18和1例XXY)，假阳性率0.12%。此项研究更进一步验证了NIPT未来在中等风险及低风险孕妇人群的应用。不谋而合的是，国外研究也表明NIPT在中等风险人群中也具有类似的灵敏度和特异度。这预示着随着临床数据的积累，未来NIPT可以覆盖到中等风险孕妇人群。

3基于高通量测序技术的NIPT的优势及局限性

基于高通量测序的胎儿游离DNA检测技术作为针对胎儿染色体非整倍体产前筛查技术的优势在于：(1)无创伤性，避免了有创性取材方式带来的污染、感染及胎儿流产风险。(2)对于目标疾病有高的检出率和低的假阳性率。该技术对于21、18、13-三体综合征等常见染色体非整倍体异常总体检出率在99%以上，假阳性率在0.1%左右，大大优于目前产前血清学筛查的效率，可以有效降低部分需要介入性产前诊断的数量，从而解决产前诊断技术或人力不足的问题。(3)适用的孕周范围较大，从孕9周以后至中孕期。(4)临床所需信息少，流程较简单，质量控制相对容易。该技术用于胎儿疾病风险计算所需要的相关临床信息很少，临床操作简单易行。(5)技术的扩展性强，未来有望扩展到染色体部分单体、三体综合征等全部因剂量改变导至的染色体病及其他遗传性疾病的检测上。

但该技术还存在多种局限，体现在：(1)筛查的目标疾病尚偏少，仅针对胎儿21、18和13-三体综合征，缩小了后续产前诊断的疾病范围。目前的产前血清学筛查实际上涵盖了除21、18-三体综合征以外的其他染色体异常，筛查疾病比预期要广泛。(2)多胎、嵌合体及父母中存在染色体异常的病例均不适于采用该技术进行筛查。因正常与异常细胞系比例不定，深度测序技术检测嵌合体存在难度。对于多胎而言也有类似情况，如多胎中的某一个胎儿患有21-三体综合征而其他胎儿为正常，该技术的检测灵敏度将降低。(3)孕妇近期接受过异体输血、移植手术、细胞治疗，孕妇体重超过100kg等将影响无创检测结果的准确性。(4)检测费用较昂贵。

4国内外应用指南及专家观点

目前国内外NIPT的临床研究已广泛开展，已经发表了一系列专业协会共识或关于NIPT的临床应用指南。2012年美国妇产科医师协会(ACOG)与美国母胎医学会(SMFM)共同发表委员会指导意见，指出胎儿游离DNA检测可以作为非整倍体高危人群的一种初筛检测，其应用指征为：(1)孕妇年龄≥35岁。(2)超声结果显示非整倍体高危。(3)生育过三体患儿。(4)早孕期、序贯筛查、整合筛查或四联筛查高风险。(5)父母为罗伯逊易位携带者。面对NIPT迅猛发展带给临床遗传咨询的种种问题，2013年美国国家遗传咨询师协会(The National Society ofGenetic Counselors，NSGC)针对无创DNA产前检测发表指南，NSGC认为：(1)NIPT当前只能作为染色体非整倍体产前筛查-诊断体系的补充检测，检测阳性结果必须通过有创产前诊断确诊。(2)因缺乏在中低风险人群中的临床数据，NIPT暂时不能替代现有的产前筛查技术。(3)现有的NIPT只能检测21、18、13-三体综合征，所以应在孕妇检测之前说明这项检测的检测范围和局限性。(4)需重视检测前和检测后的遗传咨询，并给出正确的咨询意见。(5)如果超声检查异常、家族有染色体异常病史、复发性流产、高龄、筛查阳性等，无论NIPT结果如何，都应对其进行详细的遗传咨询。

国家卫生计生委全国产前诊断技术专家组也于2012年就胎儿游离DNA产前检测技术进行了论证，指出游离胎儿DNA检测技术在目前发展阶段的目标疾病应该明确在胎儿2l、18和13-三体综合征，该检测技术是一种“近似于产前诊断水平的”、“目标疾病指向精确的”的产前检筛查新技术，应该与现行的产前筛查体系相结合，并准确把握临床适用人群。

2015年1月15日，国家卫生计生委妇幼司发布了第一批高通量测序技术临床应用试点单位，同时发布了《高通量基因测序产前筛查与诊断技术规范(试行)》，规定了高通量基因测序产前筛查在临床上的适用范围、临床服务流程及临床质量控制。规范指出，高通量基因测序技术在产前筛查与诊断领域适用的目标疾病为常见胎儿染色体非整倍体异常(即21、18、13-三体综合征)，最佳检测时间应当为12~26+6周。适用人群为：(1)血清学筛查、影像学检查显示为常见染色体非整倍体临界风险(即 1/1000≤唐氏综合征风险值<1/270，1/1000≤18-三体综合征风险值<1/350)的孕妇。(2)有介入性产前诊断禁忌证者。(3)就诊时，患者为孕20+6周以上，错过血清学筛查最佳时间，或错过常规产前诊断时机，但要求降低21、18、13-三体综合征风险的孕妇。慎用人群是指筛查的检出率下降，假阳性及假阴性率上升，或已符合介入性产前诊断的指征，知情后拒绝直接选择介入性产前诊断的孕妇。包括：(1)产前筛查高风险，预产期年龄≥35岁，以及有其他直接产前诊断指征的孕妇。(2)孕周<12周的孕妇。(3)高体重(>100kg)孕妇。(4)通过体外受精-胚胎移植方式受孕的孕妇。(5)双胎妊娠的孕妇。(5)合并恶性肿瘤的孕妇。不适用人群：(1)染色体异常胎儿分娩史，夫妇一方有明确染色体异常的孕妇。(2)孕妇1年内接受过异体输血、移植手术、细胞治疗或接受过免疫治疗等对高通量基因测序产前筛查与诊断结果将造成干扰的。(3)胎儿影像学检查怀疑胎儿有微缺失微重复综合征或其他染色体异常可能的。(4)各种基因病的高风险人群。同时规范还指出对未接受中孕期血清学筛查而直接进行高通量基因测序产前筛查与诊断的孕妇，应当在孕15~20+6周期间进行胎儿神经管缺陷风险评估。另外规范还指出了检测前后遗传咨询工作的重要性，医师应当对孕妇本人及其家属详细告知该检测的目标病种、目的、意义、准确率、风险和局限性，以及检测的种类、费用和技术流程。应当对孕妇提供检测后临床咨询及高风险孕妇的后续处理，在知情同意的前提下对高风险孕妇进行产前诊断，并负责随访妊娠结局。

综合国内外开展的临床试验及行业协会指导意见，首先是NIPT的定位问题。在临床上此检测主要定位成：高精度筛查、深度筛查、接近于诊断的筛查、高危人群的初筛等，虽然名称不同且在临床应用上还存在一定的局限性，但各国专家层面都已经充分认识到了NIPT的高灵敏度、高特异度的技术特点，最终希望给该检测一个更加贴合自己国家实际临床情况的定位。其次是NIPT目前适用人群。由于NIPT作为目标疾病指向精确的产前筛查技术，目前还难以取代现有的产前筛查-诊断技术。因尚缺乏在中低风险孕妇人群中的临床数据，目前只推荐高危人群和有特殊需求的人群，包括高龄、血清学筛查高危、有不良孕史的孕妇等。再次，NSGC的遗传咨询指导意见显而易见是针对目前该项检测的局限性和风险而推出的。让临床医生充分认识到这项检测的局限性，这对临床应用的正确使用十分关键。

最后，国内外的临床产前专家及行业共识尚未对该项技术的详细实验操作、生物信息分析以及结果解读推出标准。这预示着未来NIPT向临床推进时仍需大量工作，不仅需要国家政策层面的支持与规范和行业专家在大量临床数据基础上对此项技术做出更恰当的临床定位，也需要从事新一代测序的技术专家给予技术层面的支持，尽快推出适应我国临床现状的更全面详尽的技术标准及解读方式。

来源：中国实用妇科与产科杂志；作者：贾蓓，钟梅