分离、标记细胞外囊泡的自动化设备，可高准确率应用于临床癌症检测与分类

SpinEx核心理念是实现液体活检中EV样本处理的自动化，能‌自动进行血浆分离、将高纯度的EVs富集到微珠上，并针对多达16种目标蛋白进行荧光标记。作者设计了一个圆盘来在一个单一设备中完成整个EV的制备过程（下图a）：（1）将血浆与全血分离，（2）通过去除脂蛋白颗粒和可溶性蛋白质来富集EV，（3）将EV捕获在预先加载的微珠上，并随后对捕获的EV进行生物素化，以及（4） 标记EV。一个SpinEx圆盘布置了两个检测单元（图 b），每个单元都整合了对应于检测步骤的功能模块。

作者还设计了一个台式旋转系统来操控SpinEx 圆盘（图 d）。该系统包含一个支架和一个磁性固定器来安装转盘，一个直流电机用于转盘旋转，以及一个数字相机用于过程监控。系统可与外部计算机进行连接，用于接收用户指令。

SpinEx首先从全血中分离出EV，这一过程包括通过离心、层析以及微珠捕获（下图a）。首先进行血浆分离，将全血加入Input腔体（150 微升），离心圆盘会使细胞成分沉淀，而血浆则留在靠近盘中心的通道中。分离出的血浆会被引入层析柱色谱柱，去除血浆中的大量脂蛋白颗粒，富集EVs。接下来，SpinEx利用高密度矿物油的置换作用，将位于外周的含EV样本“推”向碟片中心，实现了‌反离心方向的流体运输‌。富集的EVs被转移到装有微珠‌的腔体中，通过物理吸附‌无偏好性地捕获整个EV群体‌。捕获后，EVs被生物素化，微珠-EV复合物随后被‌自动均等分至8个独立的标记腔室‌，每个腔室预装了针对一种特定靶蛋白的一抗。最后，加入荧光标记的链霉亲和素（用于定量总EV量）和荧光二抗，完成多重标记。

研究人员对SpinEx的每个模块进行了细致的优化。在‌血浆分离‌步骤中，作者设计了带有‌倾斜角度的分离通道，能显著加速血细胞沉降，将血浆分离时间缩短至‌4分钟‌。在去除血浆脂蛋白的步骤中，作者采用‌尺寸排阻色谱‌和‌离子交换色谱结合的方式，与传统方法相比，SpinEx去除LDL的去除率达96%，表现最优，在回收率相当的情况下，获得的‌EV纯度显著更高。在EV标记的步骤中，通过加入封闭缓冲液和使用对照抗体，显著降低了微珠和抗体的非特异性结合背景，确保检测信号的特异性。

作者最终对优化的SpinEx系统进行了‌灵敏度与定量准确性的测试，结果显示，检测限约为‌8.4 x 10^5 EVs/ml （下图b）‌，比传统的‌酶联免疫吸附法（ELISA）‌ 的灵敏度‌高出两个数量级以上。此外，为了进行定量标记物分析，研究人员开发了一种比率计量法‌，即计算每个微珠上蛋白标记信号与总EV信号的比值，有效地消除了不同微珠之间差异性囊泡负载所引起的变异。这种方法使变异系数降低了约10倍，产生了高度一致的标记物表达结果（下图 c）。

作者评估了SpinEx在临床癌症诊断中的潜力。研究共纳入了‌221份血浆样本‌，其中包括‌157名五种常见癌症患者‌（乳腺癌30例，肺癌32例，肝癌27例，胰腺癌31例，结肠癌37例）和‌64名非癌症对照者，并最终筛选了‌30个潜在的EV表面蛋白标志物‌用于多靶点分析。

作者使用约70%的样本作为训练集，使用‌支持向量机（SVM）‌ 训练分类器，生成癌症风险评分。结果显示，该模型在‌训练集‌上达到灵敏度95%，特异性97%，准确率96%；在‌独立的测试集（67例）‌ 上，该模型的灵敏度80%，准确率达‌90%‌，特异性‌97%‌，受试者工作特征曲线下面积（AUC）高达‌0.974 （图e）‌。

作者还开发了一个分类模型，用于区分五种不同的肿瘤类型。基于所有癌症患者数据，通过‌多类别逻辑回归‌选择特征标志物，采用‌一对一（OVO）SVM分类器‌对五种癌症类型进行分类。模型的整体分类准确率达到‌95.5% （图h）。不同癌症类型的EV蛋白谱形成了明显的独立簇，证明不同肿瘤释放的EVs具有独特的蛋白质组学“指纹”（图g）。