快速、低成本、高准确度：新型POC诊断工具挑战传统PCR检测

目前，临床诊断主要依赖两类技术，.‌基于核酸扩增的分子检测如PCR是诊断金标准，具有高灵敏度和特异性，并可实现多重检测。但成本昂贵，且需要专业实验室和操作人员，限制了其POCT的使用。‌快速抗原检测（RAT）作为POC替代方案，性能处于中等或较低水平，灵敏度波动很大。因此，需要开发一种新的诊断工具，保持高灵敏度和特异性的同时，具备POC检测的快速、简便和低成本特性‌，并能实现‌多重检测‌。

近日，来自西班牙的一组研究团队在杂志npj Biosensing上发表了一篇题为“Disposable Point of Care multiplexed plasmonic biosensor for rapid and specific identification of respiratory viruses”的文章。作者开发了一种基于‌无标记等离子共振技术的多分析物诊断平台，用于快速识别、区分和定量最常见的呼吸道病毒（SARS-CoV-2、流感 A/B 病毒和呼吸道合胞病毒）在鼻咽拭子中的病毒抗原，能够达到纳克/毫升级别的低检测限。临床验证表明，这种新型诊断平台具有高灵敏度（97.22%）和高特异性（100%），与基于 PCR 的分子检测具有极好的相关性。其准确性和用户友好型设计，此传感器可被定位为一种在医疗现场快速进行多重病毒感染诊断的诊断工具。

图片来源：npj biosensing

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研究团队开发了一个集成的诊断平台（如下图），集成了卤素灯、光谱仪和电机驱动的线性位移台，这些组件都集成于一个便携箱体中。作者还定制了一款一次性微流控芯片，尺寸为 50 × 28 毫米，专为一次性POCT应用而设计。选择病毒的保守‌核衣壳蛋白/核蛋白（NP）‌作为检测目标，等离子传感器芯片四个独立的传感区域（通道CH1-CH4）上分别固定了四种特异性抗体，‌CH1抗乙型流感病毒（IBV）、CH2抗RSV（A/B型）、CH3抗甲型流感病毒（IAV）、CH4抗SARS-CoV-2‌。这种蛇形布局允许从单一样本中同时检测、鉴别和量化四种不同的病毒NP。

病毒核蛋白诊断平台的工作流程。图片来源：npj biosensing

多重检测时，高浓度NP会在非目标通道中出现显著的非特异性结合信号（下图 A），作者通过在运行缓冲液中加入‌硫酸葡聚糖（DS）‌，有效抑制了非特异性相互作用（图 B）。最终得到的检测限（LOD）分别为，乙型流感核蛋白为 31.43 ng/mL、RSV A 核蛋白为 30.63 ng/mL、RSV B 核蛋白为 19.95 ng/mL、甲型流感核蛋白为 118.18 ng/mL、SARS-CoV-2 核蛋白为 10.60 ng/mL。

在所测浓度范围内，非特异性病毒纳米颗粒未观察到交叉反应。这些结果表明，该生物传感器具备同时有效识别、区分和定量四种不同呼吸道病毒的抗原的能力。

生物传感器的优化和特异性。图片来源：npj biosensing

作者还优化了‌适应临床样本（鼻咽拭子）的前处理方法，通过‌将鼻咽拭子样本与裂解缓冲液按1:1稀释、0.22 μm过滤，几乎完全消除了背景信号，大大提高了信噪比。在优化条件下，该多重生物传感器针对五种病毒NP（RSV分A/B型），获得了宽线性范围和纳克/毫升级别的检测限（LOD）（如下图）。在临床样本基质中，对SARS-CoV-2 NP的LOD为6.90 ng/mL，乙流为 32.03 ng/mL、RSV A 为 12.03 ng/mL、RSV B 为 13.68 ng/mL、对甲型流感病毒NP的LOD相对较高，为148.93 ng/mL。

鼻咽样本中的生物传感器性能。图片来源：npj biosensing

作者设计了一款专为POCT应用的一次性微流控芯片，并使用了来自医院患者的‌46份经RT-PCR明确诊断的鼻咽拭子临床样本‌（36份阳性，10份阴性）进行验证。

结果显示，与PCR结果相比，该多重等离子生物传感器展现了‌97.22%的灵敏度和100%的特异性‌。仅有一个PCR Ct值较高（33.44）病毒载量低的甲型流感阳性样本被判定为阴性。而对于除甲型流感外的其他病毒，即使是在PCR Ct值>33（即病毒载量很低）的样本中，传感器也能准确诊断（如下表）。传感器测得的NP浓度与PCR的Ct值之间存在‌极强的负线性相关关系，这说明传感器信号能够反映病毒载量的变化，提供了除定性诊断外的定量信息。