（ddPCR） 凭借其绝对定量、高灵敏度和耐受抑制剂等优势，在生命科学领域应用日益广泛。要获得可靠的结果，遵循标准化的实验流程并关注关键细节至关重要。本文将从样本准备到数据分析前，概述ddPCR实验的基本流程与核心注意点。 样本制备与质量控制 样本核酸的质量是ddPCR实验成功的基石。 反应体系构建与DNA添加量 DNA添加量：推荐动态范围为3000至100,000拷贝/20 µl反应。 建议向反应体系中加入的酶切DNA不超过1 µg（最终浓度不高于50 ng/µl）。 对于靶标拷贝数未知的样本，建议通过十倍稀释系列进行预实验，以确定最佳的起始模板量，确保数据点落在最优的数字范围内。考虑成本，可用QPCR进行对拷贝数进行预定量，再选择合适的稀释度进行ddPCR。 也可通过已知基因组大小计算每ng DNA的拷贝数，公式为： 微滴生成 此步骤将反应体系分割成约20,000个纳升级的微滴。
图1：来源于 bio-rad Droplet digital PCR Applications Guide 加样： 向DG8芯片的底部油孔中加入70 µl的微滴生成油。 将20 µl PCR反应液加入中排样品孔，注意轻柔缓慢，不要产生气泡，有气泡需要挑破。 芯片上任何未使用的孔，都必须用1x ddPCR缓冲液填充。 生成微滴： 盖上垫片，将芯片放入微滴生成仪中。约2.5分钟后即可为8个样本同时生成微滴。
图2：来源于 bio-rad Droplet digital PCR Applications Guide 转移微滴： 生成后，用移液器缓慢轻柔地将微滴从芯片上排的孔中转移至96孔PCR板中。速度过快容易破坏微滴。推荐用可以调移液速度的电枪移液。电动移液枪和手动移液枪在微滴生成数目方面会有差别。建议实验板布局按列设计，以匹配8孔芯片的格式。 微滴PCR扩增 热封：使用Bio-Rad的PXT热封机和可穿刺箔膜对PCR板进行热封。注意，使用含胶水的替代封膜可能会损坏后续的微滴读取仪。 微滴读取与样本储存 样本储存：PCR完成后，反应板可在热循环仪中10°C过夜，或于4°C短期储存（不建议超过3-4天），之后应尽快使用QX100或QX200微滴读取仪进行检测。 总结 ddPCR技术流程清晰，但每一步都需谨慎操作。从样本制备的优化与酶切，到精准的模板量控制，再到规范的微滴生成与PCR扩增，每一个环节的精细把控都是获得高精度、可重复性数据的关键。遵循上述基本流程与注意点，将能有效保障ddPCR实验的成功。 |
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