二代测序RNA建库步骤和原理

二代测序RNA建库步骤和原理的详细解释。

一、 核心原理

RNA建库的核心目标是：将种类繁多、稳定性差的RNA分子（主要是mRNA或全RNA）转换为一端连有通用接头、结构均一、可用于Illumina等测序平台进行PCR扩增和测序的DNA文库。

简单来说，这是一个 “RNA → DNA” 的转换和修饰过程。其关键挑战在于：

1. RNA的不稳定性：RNA极易降解，操作需谨慎。

2. RNA的异质性：细胞内RNA种类繁多（mRNA, rRNA, tRNA等），而通常我们只关心占比较少的mRNA（1-5%）。因此，文库构建的核心步骤之一是富集目标RNA（通常是mRNA）。

3. 测序仪的限制：二代测序仪只能对DNA进行测序，因此必须将RNA反转录为更稳定的cDNA。

二、 主要建库类型与流程

根据研究目的，主要有两种建库策略：

1. 普通转录组建库：用于分析基因表达水平。

2. 链特异性建库：除表达水平外，还能保留转录本来源链的信息，对于研究重叠基因、反义转录本等至关重要。

下面以最常用的 “ oligo(dT) 富集mRNA + 链特异性建库” 为例，详细分解其步骤。整个过程可以概括为下图所示的流程：

步骤 1：从总RNA中富集mRNA

· 原理：真核生物mRNA的3‘末端带有一段PolyA尾（多个腺嘌呤A）。

利用碱基互补配对原则，使用连在磁珠上的Oligo(dT)探针（一段由胸腺嘧啶T组成的核苷酸链）与PolyA尾特异性结合。

通过磁性分离，洗去rRNA、tRNA等不含PolyA尾的RNA，最后将纯化的mRNA从磁珠上洗脱下来。

· 替代方法：rRNA去除：对于原核生物（其mRNA无PolyA尾）或想保留部分非PolyA RNA的情况，可以使用与rRNA序列互补的探针将rRNA杂交并去除，从而富集剩余的RNA（包括mRNA）。

步骤 2：RNA片段化

· 原理：二代测序仪有最佳读长限制（如150bp）。而mRNA长度从几百到几千碱基不等，必须将其打断成200-500bp的小片段，以保证测序效率和后续组装的可操作性。通常使用金属离子在高温下进行化学片段化。

步骤 3：第一链cDNA合成

· 原理：以片段化的mRNA为模板，使用逆转录酶 和随机引物 或 Oligo(dT)引物，合成第一条互补的DNA链，形成mRNA-cDNA杂交双链。

步骤 4：第二链cDNA合成

· 原理（链特异性核心）：移除RNA-cDNA杂交链中的mRNA模板后，以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA。

  · 在链特异性建库中，此步骤使用 dUTP 来代替dTTP加入反应体系。因此，合成出的第二链cDNA中，所有原本应该为T的位置都被U取代。

  · 合成完成后，得到一个双链cDNA 产物，其中第一链是包含T的正常DNA链，第二链是包含U的标记链。

步骤 5：末端修复 & ‘A’尾添加

· 末端修复原理：片段化产生的cDNA末端可能是凹凸不平的。使用特定的酶将DNA末端“修补”成平整末端。

· ‘A’尾添加原理：在修复后的cDNA片段3‘末端添加一个突出的碱基A。因为Illumina测序接头的3’末端带有一个突出的碱基T，这样可以通过 “A-T”互补连接，提高接头连接的效率和特异性。

步骤 6：接头连接

· 原理：将测序接头 连接到cDNA片段的两端。

  · 接头是短的、已知的DNA序列，其主要功能包括：

    1. 与测序仪流动槽上的互补序列杂交，固定DNA片段。

    2. 包含索引/条形码，用于在混合多个样本测序时区分样本来源。

    3. 包含与测序引物结合的区域。

步骤 7：链特异性选择与PCR富集

· 原理（链特异性核心）：

  1. 消化：使用尿嘧啶糖基化酶 处理。该酶能特异性识别并降解含有dUTP的第二链cDNA，而保留不含U的第一链cDNA。

  2. PCR富集：经过接头连接和链选择后，仅有第一链cDNA被保留下来。通过PCR扩增，一方面对上一步产物进行富集，以获得足够的测序量。

另一方面，在PCR过程中，使用正常的dNTP（包含dTTP）合成出全新的互补链，最终得到保留了原始RNA链方向信息的双链DNA文库。例如，测序读段与第一链cDNA互补，因此它对应于原始mRNA的反义链。

步骤 8：文库质控与上机测序

· 对最终的文库进行浓度和片段大小分布检测，合格后即可上机进行高通量测序。

三、 关键总结

· 核心转换：RNA → cDNA → 带接头的DNA文库。

· 富集核心：通过Oligo(dT) 或去rRNA 方法富集目标RNA。

· 链特异性核心：通过在第二链合成中引入dUTP，并随后用酶消化含U的链，从而保留链信息。

· 通用步骤：末端修复加A尾和接头连接是几乎所有二代测序文库构建（包括DNA建库）都必需的步骤，目的是让片段化的DNA能与测序接头高效、定向地连接。