一、 Panel基本信息 Panel名称：SJPedPanel 研发单位：St. Jude Children’s Research Hospital(SJCRH) 预期用途：专为儿童泛癌设计，可检测低频突变，可用于癌症复发监测 检测范围：357个基因的5009个区域，7590个SNP位点（可达1个SNP/1Mb） 检测项目：SNV，Indel，SV，CNV, LOH，ITD 检测方法：捕获测序，PE150 检测平台：NGS测序平台 二、 Panel创新点 创新点1：panel检测的位点是儿童癌症特异的，所选的基因和区域是基于前期WES，WGS（中位深度高达3000X），RNA-seq以及更多的功能性验证获得 创新点2：7590个SNP位点，可以保证每个人可以有3000个杂合SNP位点，使得检测LOH的分辨率达1Mb 创新点3：使用自主研发的SequencErr 和SVindelGenotyper方法有效降低了测序错误率，使得Panel可检低至0.2%的突变 创新点4：Panel采用统计检验方法消除系统偏好，优于GATK推荐的Panle of Normal方法消除系统噪音 创新点5：使用标准细胞系对Panel的均一性进行了评价，可稳健地掌握每个区域的稳定性 三、 Panel可参考价值 3.1 为什么要设计针对儿童的Panel？ 目前市场上已有的panel大多针对成人且检测外显子为主。最近一项涵盖1,699例儿童癌症的泛癌症研究表明，成人癌症与儿童癌症之间存在显著差异，其中儿童癌症的142个驱动基因中有55%在成人泛癌症研究中未发现[1]。此外，除了受影响基因不同外，成人癌症和儿童癌症的基因变异类型也存在差异，儿童癌症中 62% 的驱动变异是拷贝数变异 (CNV) 或结构变异 (SV)，其断点通常不属于外显子区域。因此，针对儿童需要设计相应的基因Panel，从而可全面检测出儿童癌症相关的驱动突变。 SJPedPanel的357个基因的5009个区域选择前期耗费的资金可观，所以区域可参考的价值也可想而知。此外，该Panel的研究文献[2]提供了这些区域的详细的基因坐标，大家可以下载进行参考。 表1：6个肿瘤Panel的检测范围比较 3.2检测性能提高方法的参考价值 SJPedPanel采用SequencErr方法降低了测序仪产生的错误。此外使用reference panel对检测范围内的每个位置拟合了背景噪音数据的分布，并通过统计检验后的FDR值判断真实突变的真伪。 1）SequencErr-评估、校准和监测测序仪的准确度的方法 对于双端测序，一条序列会被检测2次，一个测序读段叫正向读段(forward strand read)，另一个叫反向读段(reverse strand read)，SequencErr认为这2条reads之间重叠区域中的不一致的碱基为测序仪判断错误的碱基，然后通过采用一些过滤方法来去掉有问题的reads，从而提高测序仪的测序准确率。SequencErr 相对于流行的质量控制方法FastQC可以更直接找出测序仪判断错误的碱基，并且比常用的其他矫正错误的软件 Lighter 和 Musket可再降低错误率10倍。
图1：测序错误矫正软件性能对比 2）消除系统偏导至的假阳 对于给定的变异，使用野生型样本（即在原始分析中诊断时未检测到突变）统计该位点处的背景错误率。即合并所有野生型样本在该位点处的reads（tb条），然后统计支持该变异的reads总数（mb条），将mb/tb作为背景错误率（Vb），从而构建Vb*tb作为均值的二项分布。类似地，对于突变阳性样本，统计支持该变异的reads总数（mf）和覆盖该位点的所有reads数（tf）。然后，我们使用二项分布计算了在tf个读段中随机观察到 ≥ mf 个突变reads的概率。如果错误发现率控制的Q值<0.05，则该样本被称为突变阳性。 可惜的是相关文献中并没有提供所覆盖位点处统计的背景错误率。所以大家也只能参考一下方法。不过，目前市场上illumina dragen针对体细胞突变检测项目提供了可以参考的背景错误率，见下图2。大家可以自行下载并参考。此外，也可以自己作类似的背景错误率，会更能针对性地降低假率。
图2：Prebuilt Systematic Noise BED Files 3）均一性评价 对于捕获测序，大家最关注的问题就是均一性，即希望自己设计的区域都有reads覆盖，且覆盖得均匀。均一性对于判断拷贝数变异极其重要。大家喜欢用Fold80评价。但Fold80只能知道整个target区域的整体上的均一性，不能评价哪些区域测得稳定，哪些区域测得不好。在SJPedPanel的性能评价文献中，使用了标准正常细胞系COLO829BL (ATCC No. CRL1980)进行了评价。该类样本容易获取，可到ATCC进行购买，且评价结果较可信。此外，评价均一性的方法也值得借鉴。由于高度均匀的捕获数据能够确保大多数碱基/区域具有相似的深度（因此直方图的标准差非常小），可使用变异系数（CV，定义为直方图的σ/μ）作为评价均一性的统计量。其中，σ和μ分别是标准差和平均值的估计值，是通过从直方图两端修剪掉2.5%的极值得到的（图3）。
图3：Capture uniformity per base (A and B) and per region (C and D) of the panel. 参考文献： 1. Ma X, Liu Y, Liu Y, Alexandrov LB, Edmonson MN, Gawad C, et al. Pancancer genome and transcriptome analyses of 1,699 paediatric leukaemias and solid tumours. Nature 2018;555:371–76. 2. Kolekar P, Balagopal V, Ma X, et al. SJPedPanel: A pan-cancer gene panel for childhood malignancies. Clin Cancer Res. 2024 Sep 13;30(18):4100-4114. |
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