测序技术的发展历程：从 Sanger 法到第四代测序的突破与展望

突破起点：Sanger 测序奠基生命密码解读

1977 年，Frederick Sanger 开发的双脱氧核苷酸终止法（Sanger 法），为基因测序铺就基石，开启人类系统性解读生命密码的序章。

技术原理：在体外 DNA 复制时，利用双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）的特殊结构。ddNTP 在脱氧核糖的 3’位置缺失羟基，能通过 DNA 聚合酶作用融入合成的 DNA 链，却无法与 dNTP 形成磷酸二酯键，使 DNA 链延伸终止。

操作与优势：将待测 DNA 模板、DNA 聚合酶、dNTP、引物及带有荧光标记的四种 ddNTP 混合进行 DNA 合成反应。DNA 聚合酶依模板指引，从引物延伸 DNA 链，ddNTP 与 dNTP 竞争性掺入，生成以特定 ddNTP 收尾的不同长度 DNA 片段。经电泳分离按长度排序，检测荧光标记确定片段末端碱基，推断 DNA 碱基序列，其准确率高达 99.99%，是当时最可靠的测序方式。

里程碑成果：1980 年，噬菌体 X174 的全基因组（5375bp）通过 Sanger 法完成测序，这是人类首次成功破译完整生物体基因组全序列。1990 年启动的人类基因组计划（HGP），前期主要依靠 Sanger 法，历经 13 年、耗资 38 亿美元完成首个人类基因组序列，被视为生命科学领域的重要里程碑。

局限性：Sanger 法通量较低，单次测序只能读取 700 - 1000bp 的碱基序列；成本高昂，达到 1000 美元 /kb，大规模测序工作面临时间与经济成本压力，亟待新技术突破。

高通量革命：第二代测序崛起

为突破第一代测序技术瓶颈，2005 年后，第二代测序技术应运而生，开启高通量测序新时代。

罗氏 454 测序技术：采用焦磷酸测序法，将基因组 DNA 打断成小片段，连接接头后与磁珠结合，在油包水体系中进行 PCR 扩增，每个磁珠上扩增出大量相同 DNA 拷贝。将磁珠放入 Pico Titer Plate 板中，多种酶协同作用下，引物与链模板结合，dNTP 按互补配对原则添加延伸 DNA 链，释放焦磷酸（PPi）。PPi 与腺苷 - 5'- 磷酸硫酸酐（APS）反应生成 ATP，ATP 驱动荧光素酶催化荧光素氧化产生荧光信号，检测荧光强度和顺序确定 DNA 序列。该技术实现单次百万级 DNA 片段并行测序，通量较 Sanger 法提升千倍。

illumina 的 Solexa 技术：2006 年推出，采用桥式 PCR 结合边合成边测序方法。DNA 片段两端连接不同接头，固定在 Flow Cell 表面，与表面引物杂交形成 “桥” 状结构后进行 PCR 扩增，形成大量 DNA 簇。边合成边测序时，反应体系加入带有可逆终止基团和荧光标记的 dNTP，DNA 聚合酶每次添加一个 dNTP 后，通过激光扫描检测荧光信号确定碱基种类，去除终止基团和荧光标记后继续反应。Solexa 技术读长可达 250 - 300bp，成本降至 0.01 美元 /kb。

SOLiD 技术：2007 年推出，运用连接酶测序。将基因组 DNA 打断成小片段，两端连接接头形成文库，与磁珠上的引物杂交，在连接酶作用下，用 8 碱基长度的荧光探针进行连接反应。探针第 1、2 位碱基对应特定荧光颜色，通过双色编码纠错机制提高测序准确性。每次连接反应后检测荧光信号确定碱基，切除探针 3' 端 5 个碱基进行下一轮连接。SOLiD 技术准确率达 99.94%。

影响与局限：第二代测序技术使全基因组测序成本大幅下降，2014 年降至 1000 美元，促进千人基因组计划、癌症基因组图谱等大型科研项目开展，也推动无创产前检测、肿瘤靶向治疗等领域发展。但存在短读长（<500bp）问题，进行基因组组装或分析复杂结构变异时依赖拼接算法易出错，且基于 PCR 扩增可能引入偏好性与错误，影响测序结果准确性和可靠性。

单分子突破：第三代测序登场

2011 年，PacBio 推出首款商业化单分子实时（SMRT）测序系统 PacBio RS，开启单分子长读长测序新时代。

PacBio RS 及后续发展：PacBio RS 采用零模波导（ZMW）纳米结构，实现单分子 DNA 聚合反应实时观测。零模波导纳米孔内固定单分子 DNA 聚合酶，孔内四周有荧光标记脱氧核苷酸，形成稳定背景荧光信号。当荧光标记脱氧核苷酸掺入 DNA 链时，特定颜色荧光持续一段时间后被切除，共聚焦显微镜实时记录荧光信号确定碱基序列。2013 年 RS II 系统发布，零模波导数量从 15 万提升至 30 万，酶化学优化，平均读长提升至 5000bp，准确率达 99.999%（Q50）。

2015 年 Sequel 系统推出，采用全新 SMRT Cell 设计，拥有 100 万零模波导，通量提升 10 倍，成本降至 0.02 美元 / 百万碱基。2020 年 PacBio Sequel II 系统完成人类基因组端粒到端粒（T2T）测序，填补 8% 的序列空白。

纳米孔测序技术：以英国牛津纳米孔公司技术为例，核心原理是利用纳米孔蛋白固定在电阻膜上，核酸聚合物在动力蛋白牵引下穿过纳米孔时，因 ATCG 单个碱基带电性质不同，引起电阻膜上电流变化，实时监测并解码电流信号确定碱基序列。该技术具有长读长、设备成本低、测序芯片可再生利用、实时获得序列信息、便携式测序装置、无需 PCR 扩增且能保留原始碱基修饰信息等优势，在新冠病毒实时监测和遗传病快速诊断等方面有应用，但发展初期错误率较高（>5%）。科研人员采用高覆盖度测序和混合测序等策略提高准确性。

创新浪潮：第四代测序迈进

近年来，第四代测序技术取得显著进展，为基因测序领域注入新活力。

高端仪器突破：中国广州生物岛实验室领衔研制的 120 千伏场发射透射电镜 TH-F120，由广州慧炬科技有限公司负责生产和商业化运营，2024 年完成首单交付。该透射电镜具备超高分辨率，能直观显示病毒和蛋白质的原子结构，助力发现药物研发靶点，在新一代信息技术领域对半导体芯片检测和工艺改造发挥关键作用，打破透射电镜进口依赖局面，为第四代测序技术微观研究提供有力工具。

人工智能助力：DeepMind 的 AlphaFold3 在蛋白质结构预测方面取得革命性进展，能以前所未有的精度预测 “蛋白质数据库” 内几乎所有分子类型的复合物结构，准确率在基准测试中比现有最好传统方法高出 50%，无需输入结构信息，为药物研发、基因组学研究等领域提供强大助力，开辟测序技术与蛋白质研究结合新路径。

企业技术创新：华大智造的 G400-ER 纳米孔测序仪通过 AI 算法提升准确率至 99.8%；DNBelab C4 实现单细胞分辨率全基因组空间定位，推动肿瘤微环境研究。罗氏计划 2026 年推出基于 SBX 技术的纳米孔测序仪，读长达 Mb 级且无需光学系统。中国企业齐碳科技的 QPrenano-32 和臻熙医学的测序仪进入临床验证阶段，加速国产替代进程，降低测序成本。

推动前沿领域研究：第四代测序技术凭借超长读长、实时监测、无需 PCR 扩增等优势，有望推动单细胞与时空组学研究取得新突破，为生命科学研究向更深层次迈进提供强大技术支撑。

应用场景广泛

测序技术飞速发展，应用场景不断拓展，从科研领域渗透到医疗健康、农业与生态等领域，展现巨大应用价值。

医疗健康领域：在肿瘤早筛方面，贝瑞基因参股子公司和瑞基因基于 cfDNA 全基因组测序技术开发的莱思宁灵敏度和特异性分别达到 95.42% 和 97.91%，可提前 6 - 12 个月实现肝癌极早期诊断，还能一次检测筛查中国六大高危癌种。在病原鉴定方面，宏基因组测序（mNGS）无需培养和预设，可全面分析样本中所有核酸，一次测试检测多种病原体，如美国加州大学旧金山分校科研团队研发的 mNGS 技术对脑脊液样本分析的准确率达到 86%。在遗传病诊疗领域，新一代测序技术尤其是三代测序技术弥补了二代测序不足，可检测与遗传病相关的基因突变或染色体异常，帮助制定个性化治疗方案，三代测序技术在罕见病领域的渗透率预计到 2030 年将提升至 20%。

农业与生态领域：华大智造完成 3000 份水稻基因组重测序，挖掘出与耐盐碱、高产等性状相关的基因，为耐盐碱品种培育提供基因资源和理论基础。在水产养殖中，单细胞测序技术可用于研究水生生物的细胞类型和发育机制，为病害防治和品种改良提供新思路。在生态研究方面，illumina MiSeq 平台通过对肠道菌群测序，发现特定肠道菌群在肥胖发生发展中起到重要作用，利用 16S 扩增子测序研究工业大麻在镉胁迫下微生物群落的适应机制，发现特定真菌能提高大麻幼苗抗逆能力。