LAMP技术！可用于遗传变异的即时检测

作者开发的新方法依赖于分别对BIP和FIP引物的F2或B2片段进行修饰。在F2或B2引物的3′端修改2 ~ 7个核苷酸，使序列与突变后的核苷酸序列相同或相反并互补。这样在存在野生型核酸模板的情况下，F2或B2引物的3′端与模板分离，防止扩增，只特异性捕获突变。其余LAMP反应引物，即F3， B3， BIP和可选的LF和/或LB环引物，根据典型的LAMP工作流程设计。

作者使用携带突变的5种人EGFR合成模板来检测该方法的敏感性和特异性。结果表明，该方法能够检测出至少250个目标序列拷贝的5种EGFR突变。从健康人（野生型）或水（NTC）中提取的人类遗传物质样品中没有扩增产物，证实了引物对靶标遗传改变的特异性。对熔解曲线的分析（如下图）也证实了该方法的特异性。

作者下一步研究了FIP或BIP引物内的修饰是否对反应至关重要，即这些引物与目标序列的结合是否决定扩增。结果显示，扩增产物仅在反应混合物中所有引物存在的情况下观察到（图A， B），而在没有FIP引物（图C， D）或BIP引物（图E， F）的情况下没有扩增产物。结果表明，FIP和BIP引物在LAMP反应中都起着至关重要的作用，BIP引物与FIP引物在功能上是等同的。

作者设计了7种不同的引物，分别在3 '端进行修饰，使其最终的1/2/3/4/5/6/7个核苷酸与插入和/或缺失后的核酸序列相同。结果证实，在单个核苷酸范围内修饰F2引物不能对靶标进行特异性检测（图A， B），WT和突变样本均可正常扩增。F2引物在2到7个核苷酸范围内的修饰，反应产物仅存在于突变模板样品中（图 C-F），说明在此条件下可以对遗传变异进行特异性检测。

肿瘤样本通常包含突变细胞和健康细胞的混合物，作者评估了设计的引物在在野生型DNA存在时对突变DNA的特异性。实验采用变异等位基因频率（VAF）分别为0.01%、0.1%、0.5%、1%、5%和100%的野生型和突变DNA混合物。检测每个样品的荧光信号所需的时间见下表。结果显示，当VAF为0.1%，0.5%，1%，5%和100%时，可在所有重复的实验样品中观察到信号；当VAF为0.01%时，在三次重复中有两次观察到产物。在仅含有野生型DNA和NTC的样品中未观察到信号。结果证实，在VAF低至0.1%的DNA中，所设计的引物对突变DNA也具有特异性。

考虑到LAMP技术的优势，作者开发了一种利用LAMP技术检测基因变异的新方法，可用于即时检测。在F2或B2引物3′端修改2 ~ 7个核苷酸，使序列与目标变异后的核苷酸序列相同或相反并互补。这种方法在存在野生型核酸模板的情况下，F2或B2引物的3′端与模板分离，防止扩增。该方法的特异性和敏感性分析证实，此检测方法具有足够的特异性，敏感性估计为目标序列的250个拷贝。利用廉价的嵌入染料产生荧光信号，降低成本。此方法可以简化遗传变异的多重检测，不仅可以用于肿瘤学，还可以用于任何需要检测遗传变异的诊断部门。