IVD前沿：基于SCas12a的检测方法，快速、经济高效、高度敏感！

近日，杂志Nature communications上发表了一篇题为“Split crRNA with CRISPR-Cas12a enabling highly sensitive and multiplexed detection of RNA and DNA”的文章。作者利用SCas12a系统，建立了一种高灵敏度、选择性和多重检测miRNA的荧光检测方法，消除了额外的逆转录和预扩增的需要。这种方法的平均LoD值为100飞摩尔（fM）。还设计了侧向流动测定法（LFA）用于快速检测miRNA， LoD更低，为10 fM。此方法能够区分具有相同序列的成熟miRNA和pre-miRNA，且对DNA和miRNA点突变具有显著的特异性。利用该方法，作者成功鉴定了宫颈癌患者的miRNA生物标志物，并以阿摩尔水平检测HPV。

Cas12a蛋白对截断的crRNA（scaffold RNA）表现出很强的结合亲和力，但该缺陷的Cas12a RNP没有表现出任何核酸酶活性，可能是由于缺乏spacer RNA。由分开的scaffold和spacer RNA组成的分裂crRNA可以诱导Cas12a中精确的顺式切割。作者利用了分裂Cas12a系统（SCas12a），包括Cas12a蛋白、scaffold RNA和spacer RNA，来开发核酸检测方法。

spacer RNA具有与miRNA相同的结构和特征，因此可设计一种直接监测miRNA靶点的“反向激活”策略（下图c）。在Scaffold RNA和过量的ssDNA激活序列（与miRNA互补）存在的情况下，miRNA靶点的存在将行使spacer RNA的作用激活Cas12a活性，无需额外的逆转录和样品扩增就可以直接检测miRNA（如下图）。

作者设计了一系列ssDNA激活序列，对与癌症进展相关的临床重要miRNA进行特异性检测，包括miR-21、miR-31、miR-17和miR-let-7a。结果显示，miR-21靶点的LoD为21 fM（图a）。其余三个miRNA的LoD范围为70 fM至294 fM，平均LoD为100 fM，且线性关系良好。

使用快速测向流动试验验证SCas12a系统的灵敏度时，观察到10 fM的低LoD，与荧光测量结果相比，降低了一个数量级。这可能是由于试纸中存在的几种成分的局部浓度增加导至。

作者评估了SCas12a荧光检测的选择性。结果显示，即使非靶的miRNA浓度高出100倍，也没有一个非靶向miRNA表现出荧光信号的增加（图a），这表明SCas12a检测的高特异性。随后作者评估了该方法是否可以同时检测多个miRNA。结果显示，靶向特定miRNA（miR-17和miR-31）的ssDNA激活剂可以单独使用，也可以将它们合用，不会相互干扰（图b）。

作者还尝试使用SCas12a检测区分含有相同miRNA序列的成熟miRNA和预miRNA。结果表明，成熟miR-21的荧光强度比pre-miR-21增加了2500倍。表明其作为检测成熟miRNA的诊断工具的优势，具有更高的精度、灵敏度和成本效益。

研究表明miR-21在宫颈癌患者中特异性过表达，作者使用SCas12a测定法测量了宫颈癌诊断患者血浆样本中miR-21的表达水平（图a）。结果证实宫颈癌样本中miR-21的总体表达水平与健康供体样本相比显著升高（图b）。RT-qPCR分析结果与SCas12a测定获得的结果有强相关性（图c）。综上所述，这些发现表明，SCas12a检测方法可以直接、快速、无扩增地识别临床标本中的miRNA，灵敏度更高，从而证实了其在临床环境中的潜在效用。

为了实现功能性RNP的完整组装，Cas12a蛋白必须正确结合scaffold RNA和spacer RNA。鉴于这一假设，作者认为与野生型Cas12a相比，SCas12a在检测DNA单点突变方面可能表现出更高的敏感性。结果证实了作者的假设，基于scas12的荧光分析证明了其在DNA和RNA靶标中可靠的SNP检测能力。

作者利用分裂Cas12a系统（SCas12a）开发了快速荧光和侧流NAT分析，该系统由Cas12a酶和分裂crRNA组成。SCas12a检测能够高度敏感、无扩增、多重检测miRNA和无复杂二级结构的长RNA，还可以区分成熟miRNA及其前体（pre-miRNA）。该系统的特异性进一步突出了其检测DNA和miRNA点突变的能力。SCas12a系统可以量化宫颈癌患者血浆中的miR-21生物标志物，并在临床样本中检测到阿摩尔水平的HPV16。总之，SCas12a提供了一个简单且具有成本效益的NAT平台。

SCas12a 具有以下几个优势：可以区分成熟miRNA及其前体（pre-miRNA），能够同时检测多种癌症生物标志物，如miRNA和ctDNA，以及对DNA和miRNA靶点突变的显著特异性。但当前版本的SCas12a检测仍然存在一定的局限性。一个明显的缺点是它容易受到目标二级结构的干扰。在未来，SCas12a检测可以与大量的Cas12a检测技术相结合，如MiCaR和Auto-CAR，以创建强大的诊断工具，能够在高灵敏度和定量的混合物中检测多种DNA和RNA靶标。总的来说，这项研究提出了一种有前途的核酸检测技术，具有在临床环境中应用于商业目的的潜力。