实验科普｜数字PCR（dPCR）是什么？（上）：概念、发展历史、实验原理

数字PCR（Digital PCR, 也可以称为dPCR）是一种核酸定量技术，能够在单分子水平上对DNA或RNA进行绝对定量。与传统的实时定量PCR（qPCR）相比，dPCR具有更高的灵敏度和准确性，因此在生物学研究和临床诊断中得到了广泛应用。本文将分成上下两篇，本篇将详细介绍数字PCR的概念、技术发展历史、实验原理。

数字PCR的概念

数字PCR是一种基于PCR的核酸定量技术，也就是本质上它还是PCR，但其反应的过程、数据分析的方法与普通的PCR却有很大区别。数字PCR通过将核酸原始样本分散成数千到数百万个独立的微反应单元，每个单元中的DNA模板可以是单个分子或根本没有DNA分子。然后这数千数万个独立的反应单元同时进行PCR扩增后，通过检测每个单元中的荧光信号来确定目标DNA分子的存在与否，从而实现对目标分子的绝对定量。

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技术发展历史

数字PCR的概念最早可以追溯到1990年代。1992年，Sykes等人首次提出了通过样品稀释和泊松分布数据处理来定量PCR产物的方法，这是数字PCR的雏形。

1999年，Vogelstein和Kinzler首次提出了数字PCR的概念，并展示了其在检测低频突变方面的潜力。此后，数字PCR技术经历了快速发展，特别是在微流控技术和液滴生成技术的推动下，dPCR逐渐成为一种成熟的技术。

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2006年，Fluidigm公司发布了第一个基于芯片的商品化数字PCR系统。2011年，Bio-Rad公司推出了基于液滴技术的QX100系统，进一步推动了dPCR技术的普及。近年来，多家公司相继推出了各种高性能的dPCR仪器，使得这项技术在科研和临床应用中得到了广泛应用。

实验原理

1. 样本分散

数字PCR的核心步骤是将样本分散成大量的独立微反应单元。常用的分散方法包括：

● 滴式dPCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）：利用微流控技术将样本分散成数万个液滴，每个液滴作为一个独立的PCR反应单元。

● 片式dPCR（Chip-based Digital PCR, cdPCR）：利用微阵列芯片将样本分散成数万个微孔，每个微孔作为一个独立的PCR反应单元。

无论哪一种分散方法，其核心思想就是要尽可能把样本中的每一个核酸分子分开，然后单独进行反应+单独检测其信号。

2. PCR扩增

在每个独立的微反应单元中进行PCR扩增。如果单元中含有目标DNA分子，PCR扩增会产生荧光信号；如果单元中没有目标DNA分子，则不会产生荧光信号。这是数字PCR能做到绝对定量的决定性条件，就像是把混杂在一起的一堆零件，逐个分开，并逐个检查，这样得到的结果会比常规的qPCR要准确得多。

可能你会问，qPCR不也可以做绝对定量吗？

qPCR提供的其是相对定量结果，即目标DNA分子的数量相对于一个已知标准品的数量。这意味着需要预先制备标准曲线，这增加了实验的复杂性。标准曲线的制备需要精确的已知浓度标准品，且标准品的质量和稳定性直接影响定量结果的准确性。

而且，qPCR在扩增初期可能会受到非特异性扩增、引物二聚体形成等背景信号的干扰，这些背景信号会影响基线的设定和阈值的选择，进而影响Ct值的准确性。

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3. 信号检测

扩增结束后，通过检测每个单元中的荧光信号。根据荧光信号的有无将单元分为阳性（含有目标DNA分子）和阴性（不含有目标DNA分子）。

4. 定量计算

利用泊松分布计算每个单元中目标DNA分子的平均数，从而推算出原始样本中的目标DNA分子的绝对浓度。泊松分布公式为：

其中，λ 是每个单元中目标DNA分子的平均数，可以通过阳性单元的比例 p 计算得到 λ=−ln⁡(1−p)。根据阳性单元的比例和泊松分布公式，计算出每个单元中目标DNA分子的平均数，再乘以单元总数，得到原始样本中的目标DNA分子的绝对数量。

对这个感兴趣的同学可以详细阅读下面的资料（来源于网络）

下一篇我们将介绍数字PCR的实验应用，以及近年来的研究方向和热点，敬请期待。