化学发光原理，及免疫测定原理！

2024-12-4 15:27| 编辑: 归去来兮| 查看: 583| 评论: 0|来源: IVD共修

摘要: 捕获法检测IgM抗体具有高特异性和灵敏度，适合早期感染的诊断

化学发光免疫分析法（CLIA）结合了高特异性的免疫反应和高灵敏度的化学发光，因此灵敏度和特异性都较高。

其基本原理是，反应体系中的发光物质，在一定的条件下发生化学反应释放能量，产生激发态中间体。这些激发态中间体不稳定，返回基态时，会发射光子。通过测量发光信号，并与标准曲线进行比对，则可以计算出样品中待测物质的浓度。

化学发光免疫分析法根据发光原理不同，可以分为直接化学发光法、酶促化学发光法和电化学发光法。

分类	示踪物	底物	发光物质	发光类型	代表厂家
直接化学发光法	异鲁米诺（ABEI）	NaOH、H2O2	异鲁米诺（ABEI）	闪光型，发光时间短，波长470nm	新产业、索灵
直接化学发光法	吖啶酯（AE）	NaOH、H2O2	吖啶酯（AE）	闪光型，发光时间短，波长470nm	Abbott、亚辉龙、迈克、西门子
酶促化学发光法	碱性磷酸酶（ALP）	1，2-二氧环己烷衍生物（AMPPD）	AMPPD及其衍生物	辉光型，发光时间长，波长425nm	迈瑞、贝克曼
酶促化学发光法	辣根过氧化物酶（HRP）	鲁米诺及其衍生物	鲁米诺及其衍生物	辉光型，发光时间长，波长425nm	安图、强生
电化学发光法	三联吡啶钌	三丙胺（TPA）	三联吡啶钌	可以持续稳定的发光，波长610nm	罗氏、普门

1. 直接化学发光法

直接化学发光法的特点为示踪物直接标记在抗体、抗原、配体或受体上。标记物中的示踪物不需要酶的催化作用，在碱性条件下直接发光。目前最常见的直接化学发光示踪物主要有吖啶酯和异鲁米诺（ABEI）。

具体发光原理为：在碱性H2O2溶液中，吖啶酯分子受到过氧化氢离子的攻击时，吖啶环上的取代基与C-9和H2O2形成不稳定的二氧乙烷，随后二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮。在含有H2O2的稀碱性溶液中，吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物能够发光，无需催化剂，且发光系统简便。这类化合物的发光特性为闪光型，加入发光启动试剂后约0.4秒内光强达到最大，半衰期约为0.9秒，极为高效。吖啶酯发光波长为470nm。反应快速，检测时间短。为了增强吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物的化学发光强度，常在发光启动试剂中添加Triton X-100、CTAC、Tween-20等表面活性剂。

直接化学发光法示踪物为化学合成，成本较低；在无示踪物的情况下，底物不能单独发光，因此本底较低；示踪物分子量较小，空间位阻较小，标记量适度提升。（个人观点，仅供参考）

2. 酶促化学发光

酶促化学发光免疫分析主要是将酶标记在抗原、抗体、配体或受体上进行免疫反应，随后免疫复合物上的酶作用于发光底物产生发光，最终通过发光信号测定仪进行测定。化学发光的强度由酶的浓度决定。辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）是常用的标记酶，而鲁米诺和AMPPD则是代表性的发光底物。

鲁米诺是一种强效的化学发光物质，通常在中性溶液中以偶极离子（两性离子）形式存在。在碱性溶液中，它转变为二价负离子，并可被氧分子氧化为能产生化学发光的中间体。在氧化剂的作用下，鲁米诺被转化为激发态，随后激发态衰变回基态并发出荧光。鲁米诺发光的原理与羰基化合物的亲核加成相关，产生的荧光为蓝光，波长为425nm左右。这类化合物的发光特性为辉光型，发光时间可持续30~60min，启动发光反应后约2min发光强度达到最大。因此反应时间较长。

由于底物在没有酶的情况下也有一定的发光因此一般本底较高；酶促反应可以放大发光过程，酶促化学发光一般灵敏度较高（样本的阴阳性分的较开）；酶促化学发光对酶的纯度和工艺较高，标记物成本会略高；酶分子量较大，可能引起免疫反应导至产生抗体，需要警惕酶分子引起的假阳性。（个人观点，仅供参考）

3. 电化学发光法

电化学发光法是将电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记抗原、抗体、配体或受体。当在电极上施加一定的电压或电流时，电极上的电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+与电子供体三丙胺（TPA）发生化学反应，产生激发态。激发态返回基态时释放能量，发光波长为610nm左右。

电极表面的电化学反应和化学发光过程可以循环进行。可以通过增加循环次数放大信号，检测灵敏度大大提高，故电化学发光检测具有高灵敏度的特点。（个人观点，仅供参考）

详解版：电化学发光原理

免疫测定原理-夹心法

夹心法根据检测物质的不同可以分为双抗体夹心法和双抗原夹心法。

1. 反应原理

双抗体夹心法：样本中的待测抗原与固相载体上的捕获抗体反应形成”固相载体-捕获抗体-待测抗原“复合物，清洗后，再加入标记抗体，形成”固相载体-捕获抗体-待测抗原-标记抗体“双抗体夹心复合物，检测信号与样本中待测抗原的量成正相关。反应原理如下图：

双抗原夹心法：样本中的待测抗体与固相载体上的捕获抗原反应形成”固相载体-捕获抗原-待测抗体“复合物，清洗后，再加入标记抗原，形成”固相载体-捕获抗原-待测抗体-标记抗原“双抗原夹心复合物，检测信号与样本中待测抗体的量成正相关。反应原理如下图：

由于夹心法需要对抗体或抗原进行标记，抗体用酶或者发光物质标记后一般情况下不会影响稳定性，但是抗原用酶或发光物质标记后容易导至构象变化导至稳定性下降，因此夹心法也有变体模式，主要体现在标记端，反应原理如下：

2. 夹心法适用范围

双抗体夹心法：需要待测抗原的抗原决定簇数量≥2个，抗原决定簇一般由四到八个氨基酸残基组成，一个氨基酸的平均分子量为110Da，因此待测抗原的最小分子量为880Da，但是实际情况下由于空间位阻原因，因此待测抗原的分子量要远远大于880Da。笔者目前遇到的最小待测抗原约为2kd（个人观点，仅供参考）。

双抗原夹心法：由于待测抗体为同型二价抗体，因此捕获抗原和标记抗原需要含有共同的抗原决定簇。如果在原料搭配时，发现没有信号，有一种可能性就是捕获抗原和标记抗原缺乏共同的抗原决定簇（个人观点，仅供参考）。

3. 优缺点

优点：（1）两种抗体均为特异性结合，灵敏度高；（2）由于使用了两种不同的抗体，夹心法可以降低非特异性结合，特异性好；（3）夹心法信号值和浓度值的比例关系很好，因此曲线宽、线性好；（4）同时反应原理简单，易于操作。

缺点：（1）易受RF、异嗜性抗体、人抗动物抗体等干扰物质的影响，需要加入阻断剂或者对原料进行改造，成本高。（2）使用夹心法检测抗体时，检测的是样本中的总抗体，无法对抗体的种类进行区分（该点有时也是优点）。（3）抗原进行标记时容易改变构象，引起沉淀或者稳定性下降。

总之，夹心法是一种高灵敏度和高特异性的免疫检测方法，适用于多种生物样本的分析。然而，其成功与否依赖于抗体的质量和选择，且在某些情况下可能受到样本中其他成分的干扰。因此，在实际应用中，需要综合考虑其优缺点，选择合适的检测方法。

免疫测定原理-间接法

1. 反应原理

间接法检测IgG：样本中的待测抗体与固相载体上的捕获抗原反应形成”固相载体-捕获抗原-待测抗体“复合物，清洗后，再加入标记二抗，形成”固相载体-捕获抗原-待测抗体-标记二抗“复合物，检测信号与样本中待测抗体的量成正相关。反应原理如下图：

2. 间接法适用范围

间接法：需要区分抗体的类别，特别是检测样本中的IgG型抗体时，一般首选间接法（标记二抗选择抗人IgG抗体）；有时也使用间接法检测IgM型抗体（标记二抗选择抗人IgM抗体）。使用间接法检测IgG型抗体时，需要考虑IgM型抗体的干扰，因此需要筛选对IgM型抗体交叉反应小的二抗（抗人IgG抗体）。使用间接法检测IgM型抗体时，需要考虑在体系中增加去除IgG型抗体的措施（比如添加IgG去除试剂等）。

PS：二抗通常是指用于识别和结合一抗（Primary Antibody）的抗体。

3. 优缺点

优点：（1）灵敏度高，通过二抗与一抗的结合，可以实现信号的放大，提高检测的灵敏度。（2）灵活度高，二抗作为标记物可以多个项目共用，且成本较低。（3）间接法的基本原理相对简单，通常只需使用一个抗原和一个通用二抗。这种简化的体系使得实验设计和操作更为直观，降低了实验的复杂性。

缺点：（1）一般特异性较差，主要是由于固相载体如果吸附了抗体，则必然会导至假阳性，因此使用间接法时，需要重点优化固相。（2）可能的交叉反应，如果二抗不够特异，可能会导至交叉反应，从而影响结果的准确性。

总之，间接法是一种灵活且有效的免疫检测方法，广泛应用于临床和研究领域。尽管存在一些缺点，但通过适当的实验设计和优化，间接法仍然是许多免疫检测中的首选方法。

免疫测定原理-捕获法

1. 反应原理

捕获法检测IgM抗体：样本中的待测抗体与固相载体上的捕获二抗（抗人IgM，抗μ链）反应形成”固相载体-捕获二抗-待测抗体“复合物，清洗后，再加入标记抗原，形成”固相载体-捕获二抗-待测抗体-标记抗原“复合物，检测信号与样本中待测抗体的量成正相关。反应原理如下图：

2. 捕获法适用范围

捕获法：主要用于IgM型抗体或者IgA型抗体的检测（为了避免样本中IgG型抗体的干扰）。IgM型抗体主要在感染的早期产生，因此适用于传染性疾病（病毒性感染）的早期诊断。

3. 优缺点

优点：（1）特异性好，检测IgM型抗体时一般需要稀释，可以降低干扰物质的浓度。（2）灵敏度高，捕获法能够检测到低浓度的IgM抗体，主要是由于IgM的效价高，只要捕获到一分子的IgM就结合多个抗原产生信号（理论上IgM型抗体为10价）。（3）捕获法的基本原理相对简单，固相载体可以共用，可以降低实验的复杂性，并且成本较低。

缺点：（1）需要对抗原进行标记，需要摸索最优条件以降低标记对抗原的影响。（2）需要稀释，导至检测时间较长。（3）容易受IgG抗体的影响。（4）捕获法的测量范围较窄，且稀释不呈线性。

总之，捕获法检测IgM抗体具有高特异性和灵敏度，适合早期感染的诊断，但也面临需要对抗原进行标记、检测时间长和信号干扰等挑战。在实际应用中，需要综合考虑这些优缺点，以选择合适的检测方法。

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