2024要翻篇了，可等温扩增还能翻身吗？

前情：分子POCT检测大戏，恒温扩增，只是个配角！

在疫情时，等温扩增红极一时！可随着疫情消散，等温扩增的境况急转直下。眼看着Lucira被收购，Cue Health破产，大家一致认为，等温扩增翻不出什么浪花！

现在2024就要翻篇了，可等温扩增还能翻身吗？

海外企业在居家检测方向前仆后继，国内企业在出海探索低收入国家的应用，同时仅有少量NMPA注册产品在红海里扑腾…

2024年04月，速创诊断两款恒温扩增芯片法生殖健康试剂盒获批三类证

2024年04月，汇先医药便携式全自动恒温核酸扩增分析仪获三类证

2024年07月，普世利华与盖茨基金会签署项目合作协议

2024年07月，宏微特斯白色念珠菌恒温快速核酸检测正式上市

2024年10月，博迪泰百日咳杆菌核酸检测试剂盒获批

2024年11月，普世利华结核病检测实现革命性突破

IVD产品中应用到主要等温技术有LAMP、RPA、NASBA、NEAR等技术

LAMP

LAMP 通过 4-6 个引物来识别目标 DNA 的 6-8 个不同区域，使用具有置换活性的 DNA 聚合酶进行反应，其中两个引物形成的环结构可引发后续的扩增反应。常见的结果检测方法包括凝胶电泳法、可视比浊法，如焦磷酸沉淀、可视比色法，如如酚红/HNB、侧向流层析（LFD）、荧光染料法，如SYBRGreen/Syto、以及荧光探针法，如分子信标探针或RNase HII底物探针、G-C淬灭探针等。检测技术差异会明显影响LAMP检测的特异性、灵敏度；

一般为2000copies/mL为界限，直裂型一般只能做＞2000 copies/mL，引物或探针筛选是关键，另外样本提取，浓缩核酸可以明显提高检测的稳定性和性能，可以做到接近PCR水平。

RPA

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)是以T4噬菌体核酸复制机制为原理，通过重组酶蛋白(T4 uvs X)、单链结合蛋白(T4 gp32)和DNA聚合酶(Bsu)的作用，在体外完成核酸的恒温扩增反应。RPA技术因为用到的酶比较多，体系较为复杂，基本建议采用纯化后核酸进行检测，采用直裂对体系的兼容能力要求高，容易性能不足、检测不稳定等；

NASBA

是一项以RNA模板进行等温核酸扩增并能实时观测结果的检测方法。该技术的检测反应有赖于AMV逆转录酶、噬菌体T7 RNA多聚酶、核糖核酸酶H、两种特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。反应在 42℃进行，可在 2 小时左右将模板 RNA 扩增约 10⁹～10¹² 倍，且不需特殊的仪器。

NASBA开发关键在于体系中各种酶的复配，不同酶组合严重影响扩增效率，例如逆转录酶中AMV和MMLV酶，常见市场产品用的是AMV酶；另外引物的二级结构比较容易影响非特异和扩增性能，而且探针一般采用分子信标，信号强度设计依赖颈环结构的△G设计。

NEAR

切口延伸扩增技术（Nicking Enzyme Amplification Reaction，NEAR），NEAR是一种链置换放大技术，是在核酸切口内切酶切刻形成的裂口处，通过聚合酶的作用以dNTPs为原料从裂口处的3’端聚合延伸，置换出等位的DNA链，由此又形成了新的完整的含有切刻酶识别位点的DNA序列。这条双链再次被核酸切口内切酶识别切割，进而开始“聚合-切刻”的循环，产生大量被置换下来的DNA单链，形成指数级扩增。

整体看，等温技术因为依赖的是酶或蛋白+较低温度等启动扩增反应，启动效率比较依赖引物序列和体系的结合能力，例如引物筛选、引物改造以及体系中扩增酶选择；并且扩增随机更强，如LAMP，所以对引物设计要求相比PCR明显增加、对不同反应液适配差异很大。

归纳了一下，不同等温扩增技术开发的一些经验：

A.其中RPA、NASBA的酶或蛋白的组合、buffer改造等比较关键

B. LAMP技术则引物用量多，结合模板区域也多，特别需要关注引物能量结构对特异性和灵敏度影响，尤其需要做好引物筛选。挺多人以为LAMP技术需要多条引物会导至扩增区域筛选困难，实际上有经验开发人员已经可以做到固定某个区域扩增、或实现SNP识别，检测性能基本和LAMP软件自动筛选的接近。

C.NEAR控制非特异扩增及其关键。

整体来看等温扩增技术的市场占有率有限，能够大规模主要是其独特的应用特点，如NASBA能够单独检测RNA，评估病原体的表达状态，国内的仁度、国外豪洛捷就应用这个特点开发产品，对比常规PCR技术一般通过核酸提取时消化DNA来实现。

等温技术吸引一些关注，更多依赖新冠大流行，在疫情期间得到发展，在家用等领域应用，如美国的早期EUA产品有不少是基于LMAP、RPA技术。下面简单列举了一些例子

LAMP技术，拥有LAMP底层专利的日本荣研、国内优思达（类似技术CPA）也注册NMPA的新冠试剂，有趣的是他们也基于其笔筒式核酸提取装置，开发了PCR平台；

当然，少不了在新冠期间的美国FDA批注了Lucira、Detect的EUA产品，他们都是采用了显色法报告方式，另外lucira的检测限是2700 GE/swab, detect是 313 copies/swab（官方换算是800 copies/ mL buffer）。看起来并不低，但从文献报道或官方FDA等看到，lucira的阳性符合率是91.1%，并且和ct＞36时符合率下降较多（Rapid SARS-CoV-2 Detection Using the Lucira™ Check It COVID-19 Test Kit）、真实世界测评的阳性符合率是93%（Real-world evaluation of the Lucira Check-It COVID-19 loopmediated amplification (LAMP) tes）。

整体来看，LAMP技术的产品和PCR产品性能是有一定距离并且产品适配不够，尤其在这种采用直裂法样本处理，需要适配真实世界的多种临床样本类型，或不同状态下的同一种样本类型，性能、兼容性就不足，例如Lucira/detect/cue都主要适配拭子，不会有适配保存液。

RPA技术。RPA是TwistDx公司的专利技术，后来雅培公司通过收购获得了该技术专利，其以RPA为基础的TwistAmp®核酸扩增产品。国内杭州有众测生物科技有限公司和江苏省奇天基因公司，其中杭州众测生物科技有限公司结合RAA技术和CRISPR免疫层析法，开发出了新冠核酸检测试剂，有NMPA注册证。ERA，则是苏州先达基因科技有限公司的技术，业务覆盖涵盖食品安全、畜牧水产、分子诊断等领域。更出名的就是，获得EUA的CUE health，也是采用RPA+电化学形式，其中其他样本处理采用超声裂解，检测则通过电化学形式，具体原理是：靶标上下游引物分别标记生物素和辣根过氧化物酶(HRP)、内标上下游引物分别标记地高辛和辣根过氧化物酶(HRP)，使得扩增产物带上特定标记。生物素标记的靶标和地高辛标记的内标产物可与对应的亲和物质结合，被固相载体（如磁珠）捕获并固定在检测区域，底物进入检测区后，HRP催化氧化还原反应，产生可被检测的电流，由此根据电流信号判断阴阳性。

NASBA，类似的主要有仁度生物（类似技术SAT），以及豪洛捷的TMA技术，主要特点就是检测RNA，产品宣传主要是可以指征病原体的感染状态。他们两家的产品特点主要是常规的核酸提取后通用PCR平台检测，或者采用工作站形式实现。

NEAR，最著名的是特朗普代言的雅培Alere的ID Now产品，其他特点主要是检测时间比较多。有趣的是，样本处理主要是采用热裂解形式，也只有新冠、GBS等少量产品，国外文献测评其性能不足。

等温扩增技术比较让人诟病的是特异性以及灵敏度（临床测试时的阳性符合率），重点还是在临床评价是体现出来（企业官方做Analytical sensitivity，即检测限时可能数值并不低，毕竟是最优条件），例如Mesa Biotech公司的Accula（一步法提取） 的阳性符合率仅为68.0%， 美国雅培公司的ID Now（恒温扩增） 的阳性符合率为78.8%。一般认为ct≥30，存在比较大比例的假阴。

等温扩增技术还能有什么应用方向？等温技术还有一定市场，认为主要因为其整套产品（包括检测仪器、试剂）落地的成本更低，然后性能尚可（胶体金和PCR之间）的前提下，在某些特定市场下还有不多的一席之地。下面就介绍一些应用情况，供大家产品开发的思考。

1) 国外市场家用诊断场景。

作为监管思维较为领先的美国FDA的EUA场景，新冠疫情的爆发增加了消费者居家自检更多身体健康状况的意愿，这也进一步扩大了自我诊断产品的市场，继新冠单检后，注册了新冠甲乙流产品。

2)国内市场实验室场景。

疫情后优思达也连续获得等温技术平台下的多个IVDR、NMPA产品证书、上海速创的恒温扩增芯片法获得CT/NG/UU检测试剂盒、B族链球菌的试剂盒的NMPA证书；当然，也有可能是疫情期间启动注册的陆续落地。面对目前激烈竞争市场，等温扩增技术平台不一定能够抢占到PCR平台产品的市场。

3)非盈利组织（NGO）对低收入国家的产品开发支持。

为什么还会有这些场景？本质等温扩增仪器的价格远比荧光定量PCR仪器便宜落地更容易。等温扩增技术基本采用直裂型，样本处理简单，过程少；扩增技术是恒温扩增，仪器实现和成本更低，另外和检测结果报告采用了显色法或荧光法（结合指示灯显示）或侧向层析法，仪器实现难度低，直接报告结果，简单明了。

下面是一些具体资助信息。

1）Lucira COVID-19 & Flu Test  2023年2月24日，美国食品药物监督管理局（FDA）为首个可以区分新冠和流感的非处方（OTC）家庭诊断测试盒颁发了紧急使用授权（EUA）。（Ref 澎湃网）

2）Aptitude medical 2023年6月，获得盖茨基金为期5个月的95.59W美金（折合约670W）资助，开发STI产品。通过广泛提供负担得起的性传播感染检测，特别注重服务不足、资源匮乏的环境，增进全球健康。它旨在增强个人能力、降低医疗成本并提高可扩展性。（Ref  Aptitude medical官网）

3）广州普世利华。2024年7月2日，签署了关于“性传播感染（STI）项目”的合作协议，共同致力于减轻中低收入国家性传播感染负担。

①要不要核酸提取？

核酸提取可以显著提高检测限、稳定性。具体例子就是优思达的笔筒式的提取扩增一体管，检测限可以达到200copies/mL，临床评价也比较高；而lucira、ID Now采用直裂法，一些报告结果ct≥30后性能明显下降。另外也可以兼容多种样本类型血液、拭子、粪便等等。

② 检测仪器样式，如何组合？

分为分体式/一体式，后者一般接近样本进结果出。如何组合，关键是做到检测稳定、性能满足（可以是特定场景，举例低收入国家似乎对产品可及性远大于性能，所以存在可能性）、以及成本适宜。一直觉得开发小型化、快速检测、简易式核酸保证性能、成本适宜的话，等温扩增平台也是可以满足特定市场需求，Cue在前三者做到还不错。

1）小型化的平台一般采用的是直裂法的样本处理，对应采用了分体式，例如优思达的PortNAT核酸自测系统、普世利华的minidock系统。这种思路，一般无法兼容一些难处理样本，如血液、组织、粪便样本；最好兼容是比较干净的样本，例如呼吸道拭子；检测限不足，例如lucira等资料检测限是2000copies/swab上下。

当然也有采用磁珠法、离心柱法提取后，然后加入等温扩增平台。这样组合必然需要和荧光PCR的通用平台在分区实验室竞争，明显得不偿失。

2）一体式，例如速创全自动恒温核酸扩增分析仪，集核酸裂解、纯化、扩增、检测、报告于一体，“样本进，结果出”，另外还有就是EasyNAT核酸扩增检测分析仪平台。这种一体式平台会受到现在荧光定量PCR平台竞争，成本，性能与TAT，拉不开足够距离。

③如何提高等温扩增的耐抑制？

一般思路是对buffer进行改造，常见PCR添加剂也可以加入。例如BSA可以改善血红素抑制、甜菜碱可以消除尿素影响，此外亚精胺对也有用，文献里显示盐酸胍能够提高检测速度这个也很有趣。在2020年张峰的NATURE期刊里做了系统研究。

④ LAMP技术的的分析灵敏度（检测限）、分析特异性一般能够做到怎么样？

检测限：根据查阅美国EUA以及开发经验，一般RNA靶标能够比较稳定做到2000copies/ml；DNA靶标可以做到500copies/mL。另外可以参考一些国内外LAMP产品一般采用增加反应数提高检测性能，可以看到即使是单联检的产品他们检测装置都是多孔。

特异性：LAMP技术的特异性主要依靠引物筛选实现。另外，根据报告方式不同，还有不同实现方法：1）染料法或显示法一般通过调整buffer成分提高特异性，另外比较好的思路可以通过扩增时间来提高特异性；2）探针法：则通过探针特异性来实现。在PCR定量平台可以实现极低的假阳性概率。

⑤检测结果报告方式的如何选择？

报告方式包括可视比色法、侧向流层析法（LFD）、荧光染料法，如SYBRGreen/Syto、以及荧光探针法。一般采用了显色法如lucira、电化学法如cue，还有就是PCR平台的POCT产品visby采用了酶催化底物法；国内的优思达则自测平台是侧向流层析，一体式仪器则是探针法；另外普世利华用的RHAM法，应该是探针法。没有明确说哪种方法最好，只能根据不同思路考虑：

1）侧向流层析可能需要考虑试纸条的产物污染、试纸条保存，可能性能不足；

2）电化学，国内实现难度大，考虑检测稳定性；

3）显示法，实现难度低些，但是应该性能可能不足；

4）探针法可以实时检测、性能和特异性应该较高，但是需要考虑探针本质是接近杂交，可能容易受到碱基变异影响；另外实时检测的扩增曲线最容易受到样本纯度影响。

5）酶催化底物法，设计难度较大，对微流控要求较高。

⑥仪器平台选择及其影响？

建议和预期产品场景匹配。

1）如果要应用到实验室场景，和QPCR产品竞争，建议直接适配通用性PCR仪器，操作不会简便，性能未必优于PCR；或者开发集合样本处理、检测、报告的POCT仪器，仪器一般不会太大，但是成本优势、检测性能、平台稳定性未必比QPCR平台有优势；不建议采用这种开发策略。

2）如果应用到药店、宠物店、门诊等非分区实验室。建议采用一体式的POCT、其次是分体式POCT。其中药店、宠物店等机构众多，越是集成式的“样本进结果出”，其检测更稳定、性能更优，友好程度更高，无形节省了售后的成本或工作。分体式，考虑操作者一般未被系统培训，极容易出现异常结果。另外无论国内外一般很少见采用等温扩增技术POCT在门诊场景，应该是基于可靠性、成本、固有分区实验室管理经验所限制，短期无法放开。举例Xpert的POCT仪器在国外也是在实验室应用居多。

3）最后是猪场、野外，极简单的实验条件。例如低收入国家在结核、生殖道感染领域一直被WHO或NGO组织推荐“有检测好过于没有检测”的逻辑，希望更多低成本的检测平台或技术应用到低收入人群中；

⑦LAMP技术开发要点：Buffer、引物…

1）buffer。一般基于检测速度、特异性、兼容前处理过程、适配更多样本类型来调整buffer配方。

2）引物。LAMP技术的检测限、特异性等参数严重依赖引物筛选；文献报道中也创新地引物stem 引物提高检测速度和检测限、硫代修饰引物降低反应温度；

3）其他组分。添加剂可以明显改善检出时间、若采用探针法，则探针筛选是特异性关键。

⑧LAMP技术的创新应用示例

1) 测试SNP，如耐药基因检测。文献报道在引物延伸端、探针法实现SNP检测；

2) LAMP技术和分型。也有报道通过探针法来区分不同病原体型别。

3) LAMP技术和呼吸道联检。例如美国lucira的新冠流感三联检的应用。

4) LAMP技术和生殖道健康应用。Aptitude medical获得盖茨基金资助，用于开发STI产品。

等温技术目前尚有还有一定市场，应该是其整套产品（包括检测仪器、试剂）落地的成本更低，然后性能尚可（胶体金和QPCR之间）的前提下，在某些特定市场下有不多的一席之地。这个特定市场可能对无需实验室条件、对仪器成本敏感，对检测性能尚未提高、QPCR教育不足的地方。值得注意的是等温扩增技术产品的试剂成本，并不比QPCR产品低，检测性能也没有和胶体金试纸条拉开足够距离。可以遇见的是，等温扩增平台极有可能是在胶体金和荧光定量PCR中夹缝生存。

需要警醒的是，百元级别的PCR平台极有可能是压死等温扩增技术应用发展的最后一根稻草。关键是这个平台如何共赢落地？如果LAMP技术早期开放专利是否其市场发展会比现在更友好？