液体活检通过微创和可重复的检测提供整个肿瘤的动态分子信息，为精确肿瘤学提供了机会。通过早期病变检测、最小残留疾病跟踪、耐药谱和肿瘤复发监测等个性化治疗决策，可以影响患者护理。细胞外囊泡（EV）是液体活检领域内的有潜力的分析靶点。检测EV信使RNA（mRNA）可以产生丰富和可操作的临床信息。EV mRNA可以反映体细胞驱动突变；很少包含具有耐药性相关蛋白，但却对应的mRNA，以告知耐药性状态。因为EV mRNA被封闭在囊泡内屏蔽了核酸酶，可分离出完整的、高质量的核酸，补充了循环肿瘤DNA（ctDNA）的优势。 然而，EV的临床潜力仍未得到充分利用，主要是由于技术缺陷。在EV样本中的mRNA拷贝数可能很低。此外，肿瘤来源的EV只占总循环EV的一小部分（<5%），这需要大的样本量（超过2 ml的血浆）和复杂的检测方法。这降低了EV试验的竞争优势，并使其与常规临床前和临床试验的整合复杂化。 近日，杂志Nature biotechnology上发表了一篇题为“Amplifying mutational profiling of extracellular vesicle mRNA with SCOPE”的文章。作者提出了SCOPE平台来分析EV，SCOPE利用了Cas13a和信号模板之间的协同作用。Cas13a首先识别其靶标RNA，然后同时扩增RNA靶标和荧光信号，可区分单核苷酸多态性，灵敏度可达亚渺摩尔（attomolar）。这种检测方法可以促进临床前和临床机会来解剖癌症生长过程，识别耐药性的出现和衡量肿瘤对治疗的反应。 图片来源：Nature biotechnology 主要内容 SCOPE原理概述 SCOPE通过一个信号模板将Cas13a/crRNA和聚合酶反应结合在一起（图a）。信号模板设计为RNA-DNA杂交，包括(1)可被Cas13a/crRNA切割的荧光RNA片段，(2)荧光基团和猝灭剂以及(3)用于T7聚合酶转录靶RNA的DNA模板。 SCOPE反应的主要步骤（图b）。(1) Cas13a/crRNA能够识别并与EV RNA靶标结合，激活其核糖核酸酶功能。（2）被激活的酶切割信号模板中的RNA片段，产生荧光信号并暴露DNA模板。（3）T7 RNA聚合酶结合到DNA模板的启动子区域，并复制RNA靶标。（4）游离的Cas13a/ crRNA进一步识别RNA靶标副本，加强整体反应。 作者还简化了临床EV分析的RNA提取和检测步骤（图c）。RNA在涂层管中快速从EV裂解液中提取（10 min）。随后，在一个紧凑的便携式装置中发生等温SCOPE反应，在30 min内产生分析结果。该检测方法在1小时内产生分子信息，并且只需要少量的样本（例如，从<100µl血浆中分离出的EV分离物），使当天的临床决策成为可能。
SCOPE概述。图片来源：Nature biotechnology SCOPE仪器 作者实现了紧凑的模块，以促进分析过程和增强最终用户的友好性。第一个模块是用于核酸提取的pDMAEA试管（图a)，简化了整个分析工作流程。它促进了快速核酸提取（10 min），并能够在同一试管中执行SCOPE反应，消除了样品转移的需要。 第二个检测模块是一个用于平行SCOPE测量的紧凑装置（图c）。它集成了托盘式加热块、荧光光学探测器和扫描仪。加热块可以容纳16个PCR管，该系统生成预先编程的温度曲线（例如，等温和热循环）。反应完成后，光学检测器测量荧光信号（图d）。该探测器由两个独立的荧光激发/检测头组成，可用于两种不同的荧光染料。系统操作通过外部终端设备上的图形用户界面进行控制。
SCOPE仪器。图片来源：Nature biotechnology SCOPE测定的表征 SCOPE通过其双扩增方案（荧光信号和mRNA靶标）获得了高灵敏度，检测限（LOD）达到亚渺摩尔（attomolar），比RT-PCR的LOD低109倍以上（KRASG12D）（图a）。在分析EV作为mRNA来源时，SCOPE的LOD约为每毫升105个EV，比RT-PCR的LOD低103倍以上（图b）。 SCOPE也显示出极好的序列特异性，允许精确区分点突变。SCOPE一致显示了on-target和off-target样本之间的高信号-背景比（图c）；对于1 nM的目标浓度，不同KRAS目标之间的比值大于30。SCOPE的高选择性使对具有低变异等位基因分数（VAFs）的样本的可靠分析成为可能。
SCOPE测定表征。图片来源：Nature biotechnology SCOPE用于动物模型中肺癌的早期发现 作者采用了肺腺癌基因工程小鼠模型（KP模型），其具有KrasG12D+/-p53-/-突变，并在肿瘤发展的不同阶段收集血液样本（图a）。结果显示，EV谱分析结果始终与细胞KRAS状态相匹配（图b）。来自KP1.9细胞的EV表现出KrasWT和KrasG12D的高SCOPE信号，纯合子细胞系的EV只对KRAS靶点呈阳性。 对于癌症（n = 10）和对照（n = 3）队列，作者收集了纵向血液样本，并分析了血浆EV的KrasG12D mRNA。结果显示，在非癌症小鼠中，SCOPE信号在整个实验过程中都保持在背景值。在荷瘤小鼠中，一旦癌基因表达被诱导，SCOPE信号即从背景中增高并在肿瘤生长约5周时达到饱和（图d）。这些发现支持了SCOPE在检测早期肿瘤、微小残留疾病和/或复发方面的潜力，特别是在涉及已知突变的病例中。
SCOPE的早期癌症检测。图片来源：Nature biotechnology SCOPE在临床护理过程中监测结肠直肠癌患者 作者还进行了临床研究（图a）。来自术前CRC患者（n = 107）和非癌症对照组（n = 15）的样本的初始EV谱SCOPE分析结果，,确定了一组CRC患者（n = 17），其突变类型与其组织KRAS状态相匹配（图c）。 作者进一步监测了17例KRAS突变患者的RKRAS。14例患者最终被认为是非复发的，其余3例被认为是复发的，这些病例通过手术切除或放射学发现病变得到证实。在非复发患者中（图e，左），RKRAS持续下降，与良好的临床结果相一致。相比之下，复发患者的RKRAS值出现反弹，最终恢复到术前水平（图e，右）。这些分析为开发基于EV的预后指标提供了机会，以指导辅助治疗的选择和持续时间。
SCOPE在临床护理过程中监测结肠直肠癌患者。 图片来源：Nature biotechnology 总结与讨论 作者提出了SCOPE平台来分析EV。SCOPE利用了Cas13a和信号模板之间的协同作用。Cas13a首先识别其靶标RNA，然后同时扩增RNA靶标和荧光信号，可区分单核苷酸多态性，灵敏度可达亚渺摩尔（attomolar）。SCOPE在短时间内（30 min）内通过一锅分析，可以使用现成的实验室工具进行。这些优势将有助于整合到学术和临床前和工业实验室。 SCOPE显示了各种临床应用的潜力，包括早期肿瘤检测、复发监测、残余疾病评估和肿瘤分型。检测方法快速（信号产生<30分钟），且成本效益（每个标记物<4美元）。这些发现说明了SCOPE作为诊断工具的多功能性和可负担性，以加快临床决策（当天周转），跟踪癌症复发/微小残留疾病，衡量对治疗的反应（试验主持下的常规和实验），并实现及时的临床前结果，以支持药物开发工作。 |
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