【冯仁丰】任何时候不要忘记检测结果的可靠性

示例叙述

一个66岁白人老年男性，具有2型糖尿病（T2DM）、充血性心力衰竭和慢性肾病的病史，定期门诊。HbA1c检测使用Sebia CAPI3 TERA毛细管电泳（CE），得到检测结果为HbA1c为9.1%（正常范围4.0-6.0%），发现电泳图中有一个未知的趋向阴极到HbA0的小峰。这个峰部分与HbA0重叠，具有一个相似的大小（图1A）。病人没有贫血或相关症状。因为这个非经典图示，没有报告HbA1c结果，对病例做进一步研究。

当时的空腹血糖浓度为8.7 mmol/L；在过去的3个月里，空腹血糖浓度范围为6.1-8.7 mmol/L。病人以往HbA1c和空腹血糖，在6个月前为6.4%和6.9 mmol/L(表1)。使用阳离子交换的HPLC方法（Tosoh），没有检出非经典的血红蛋白变异体。

由于未知的血红蛋白变异体处于Hb F区带，关注了对HbA1c定量的潜在干扰（即，若HbF>23%，这是参照厂商的说明书）。为了确定是否变异的血红蛋白是HbF，使用Sebia毛细管电泳对标本进行检测。证实有类似的峰与Hb A覆盖，但不在Hb F区带（图1B）。按照Sebia用户手册，变异峰在某个区带的，不含有任何共同的病理变异体。为了与以往HPLC方法比较，我们也在Tosoh G8上对这个标本检测了HbA1c，结果为5.8%，没有任何血红蛋白变异体（图1C）。

病例讨论

Hb A1c是非酶糖化反应的主要产物（即，血红蛋白β链的N-端缬氨酸和葡萄糖间的反应）。一旦形成稳定的HbA1c，它持续地存在于血红蛋白和红细胞完整生命周期；所以，它反映了在过去的90-120天给定的正常糖化率下，血红蛋白和RBC稳定周转下，平均血液葡萄糖浓度。HbA1c说明了与估计的平均葡萄糖（eAG）的直接关联，并在糖尿病病人长期血糖控制与管理上，具有重要的指导意义。

许多方法可以检测HbA1c，在常规实验室可以使用的有HPLC（阳离子或阴离子交换）、CE、亲和层析、酶学方法、和免疫方法检测。

HPLC和CE二者从HbA0中分离HbA1c与一些Hb变异体，通过净电荷的差异，并计算出HbA1c%。另一方面，亲和层析检出了所有被糖化的Hb类型；酶法检出了无论Hb变异体的类型上，糖化的N-端缬氨酸。同样，HbA1c 免疫检测方法利用了抗体，去识别某个N-端糖化缬氨酸上的决定簇和少量连续的氨基酸，因此，几乎所有糖化的Hb变异体都不会干扰免疫检测方法，除非紧靠在血红蛋白β链N-端缬氨酸附近位置的某个突变改变了决定簇。HPLC和CE检测HbA1c方法具有可检出一些共同Hb变异体的优点，但它们依然会受到Hb变异体的影响，与HbA1c或HbA0覆盖在一起。相反，其他方法没有分离Hb变异体，在存在大多Hb变异体的情况下，去检测HbA1c，但其中一些是病理变异体，改变了RBC的周转。所以，PLC、HPLC报告的“HbA1c”结果，会不正确地反映病人的糖化控制状态。

本例，使用的检测方法从HPLC改变为CE，导至了一个T2DM病人的HbA1c结果出现未预期的增加，按照厂商的说明没有报告。这个未预期的结果与过去3个月的病人空腹血糖不一致，显著地大于以往HbA1c值（表1）。另外，电泳图谱说明了，是由于有一个变异的Hb，没有完整地与HbA0分离，从而引起不准确的HbA0的检测。因为没有观察到有外加的峰临近HbA1c，这个变异体的糖化，可能与HbA1c混合，被软件一起定量（图1A）。依据在CE上计算方法的HbA1c%，HbA1c的峰面积几乎看来包括了HbA1c和糖化的变异体（在HbA0 + HbA1c的分母中），所以，产生的HbA1c%假性偏高。标本经以往HPLC方法检测，HbA1c为5.8%，与临床观察和以往结果较一致，层析说明是正常图谱（图1C）。尽管HPLC和CE二者都分离HbA1c和HbA0，但它们对某些Hb变异体展现了不同的分离图谱。所以，CE分离了部分变异体，看来几乎与HbA0在HPLC上共同洗脱，它没有像HbA0部分那样被分离开和被量化。事实上，这个被HPLC计算的HbA1c代表了在总Hb中主要的糖化Hb百分值，它类似于在免疫方法或酶检测方法中计算的HbA1c。这个被证明是真实的，通过在外面实验室以酶学检测方法检测标本（HbA1c%=5.6%）。以酶法和HPLC检测的HbA1c结果，与长期葡萄糖浓度关联，如果这个变量是非病理性的，没有显著影响RBC的寿命。

为了确定证实变异体Hb的存在，使用CE以我们实验室设计证实Hb变异体的做法进行检测。标本也送到参考实验室做进一步确定Hb变异体。该变异体被确认为Hb Athens-GA，通过结合HPLC、等电聚焦、和质谱。

  Hb Athens-GA是一个Hb变异体，因某个氨基酸取代（精氨酸-赖氨酸），在血红蛋白β亚单位的第40个位置，这个变异体减少了它的阳性电荷，使得它migrate迁移在CE和碱性凝胶电泳中，与HbA有不同的移动。通过阳离子交换的HPLC方法检出这个变异体的能力，会在不同的仪器厂商间展现出不同，甚至在不同的检测程序间，如，相同仪器的不同实验条件。因此，怀疑Hb Athens-GA被常规使用的HPLC方法低估，在过去存在较低的分辨率。尽管该变异发生在涉及α-β链相互反应的区域，这个变异体具有正常的氧转换的能力，但对氧的亲和性大于HbA。Hb Athens-GA被考虑为非病理的变异体，仅在白人有报告，在杂合子中，47.4%-51.4%的血红蛋白有变异体。杂合病人是无症状的，会被CE进行HbA1c检测时，呈非典型的电泳图谱，进而被发现。

由于这个病人血红蛋白分析报告与杂合子的Hb Athens-GA一致，且没有其他病理因素影响RBC寿命，经酶法检测的HbA1c结果被认为是可靠的，进行报告。并通知了医师关于非病理性的Hb变异体信息，建议未来使用非-CE方法对这个病人进行HbA1c检测。

 这个示例说明一个问题，当实验室改变方法具有高分辨率下，会出现新的干扰Hb A1。CE，较HPLC，在检出一些Hb变异体较敏感；但是，在变异体分离不完整下，HbA1c%不可被准确地计算。对于杂合子非病理变异体，HbAc%可以使用免疫检测或酶法检测估计，作为疾病长期监测；改变检测方法，如：果糖胺或糖化白蛋白，可在变异体已知会改变RBC寿命下使用。最重要的是，实验室人员需要熟悉HbA1c检测方法的局限性，这样可以在转换一个新方法时，有所准备；另外，对具有方法特异干扰的病人样品，建议考虑使用其他方式进行检测。

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