重塑标准，基于纳米孔技术的全质粒测序

质粒是现代生物学实验中不可或缺的重要工具，其质量直接关系到研究的准确性和可靠性，有研究团队对全球多个地区的科研和工业实验室的2500多个质粒进行了深入分析，结果显示，近50%的实验室自制质粒存在明显的设计缺陷和序列错误(Bai et al., bioRxiv, 2024)。

该研究发现，大约15%的质粒存在设计上的明显错误，而大约35%的质粒在功能区域存在序列错误。总体而言估计45-50%的实验室质粒包含了未被检测到的设计和/或序列错误，这可能对其预期应用造成损害。

实验室自制质粒错误分析 (Bai et al., bioRxiv, 2024)

受限于需要载体特异性引物、质粒骨架的排除以及无法解析重复区域、二聚体和缺失等原因，作为测序金标准的Sanger测序，在全质粒测序验证方面略显局促。基于纳米孔测序的全质粒测序，则凭借测序原理上的差异，为质粒的序列验证提供了完美的解决方案。

纳米孔测序是一种区别于传统Sanger测序的创新测序技术，能够实现更快、更准、更便捷的测序方法。其工作原理是将DNA的一条链通过纳米级的小孔，根据实时监测并记录核酸链通过纳米孔的电流变化图谱，直接将不同碱基产生的特征性电流信号识别成对应的碱基，以此实现核酸序列的读取。无需PCR即能快速读取出长达上百万个碱基的读长数据，具有超长读长和实时测序的显著优势。

纳米孔测序平台组件，图片取自Oxford Nanopore Technology官网，https://nanoporetech.com/platform/technology

在对完整质粒进行测序时，纳米孔测序技术相较于传统的一代Sanger测序，展现出了更快、更准、更便捷、成功率更高的显著优势。

准确性更高：纳米孔测序不受质粒大小或复杂度影响，可以全质粒直接测通，对含大片段重复、高GC、等位基因等都可准确测序和组装，大大提高了测序的成功率和准确度。

流程更便捷：无需提供引物，即可完成测序和组装分析，样本准备和测序更为便捷。

成功率更高：测序成功率高达99.9%。

本文结合康为世纪的数万份样本检测经验，对于基于纳米孔技术的全质粒测序应用进行了对比分析，希望对研究人员有多启发。

针对无参考序列的复杂质粒，一代测序需要采取长片段walking策略，进行多轮引物合成后再测序，可能需要数天才能完成全质粒测序。相比之下，康为世纪采用纳米孔全质粒测序技术，在收到质粒样品后的次日即可完成测序工作并交付检测结果。

如上图所示，某实验室寄送测序的BAC质粒 (145 kb)，第二天即交付测序结果，成功组装，结果和客户预期一致。

当待测区域GC含量高，或有重复区域和发卡结构时，一代测序信号迅速衰减或产生重叠峰，无法得到准确的测序结果。康为世纪纳米孔测序可完美测通，无需担心测序失败。

如上图所示，康为世纪纳米孔测序方案可以轻松测通高AG重复序列。

一代测序可能会出现片段前后部分区域不准确、引物区域测不到的问题。纳米孔测序技术原理与一代不同，能够保证包含引物区域在内的整条片段测序结果都准确可靠。

康为测序准确测出引物区域及首段30 bp序列

一代测序首段30 bp信号杂乱

纳米孔测序可对二倍体样本提供准确的序列信息，能够解决一代测序和二代测序无法确定变异存在于哪一条单倍型序列的问题。

质粒图谱构建中基因插入方向标记错误

某实验室使用外借载体在实验中发现使用不稳定（有时候能成功，有时候也不能成功），研究人员使用一代测序进行测序未发现异常。基于康为世纪的纳米孔全质粒测序及对比分析，发现质粒图谱构建中将多个基因插入方向标记错误。

数据分析流程：

1. 使用SnapGene软件，将全质粒测序结果同质粒参考图谱比对时，三代结果有2000多bp的缺失，多个基因未包含，进行数据复核后，发现三代结果中还有一段不能比对到质粒参考图谱；

2. 将未比对序列复制后，同质粒参考图谱比对，发现同缺失的三个基因能够匹配，但是方向正好相反。

参考文献：

Bai X, Hong J F, Yu S, et al. Prevalence of errors in lab-made plasmids across the globe[J]. bioRxiv, 2024: 2024.06. 17.596931.