师兄带你彻底搞懂NGS

2024-9-3 10:33| 编辑: 归去来兮| 查看: 2560| 评论: 0|来源: NIRO科研喵

摘要: NGS技术的基本原理是通过将多个物种的基因组放在同一个板上

前言：在生物学的世界中，每个生命体的密码都藏在其DNA之中。随着技术的进步，新一代测序技术(Next-Generation Sequencing, NGS)已让我们能高速、高通量地解读这些编码。今天，就由我来带领大家深入理解NGS的原理与应用。

什么是二代测序(NGS)

NGS技术，也被称为深度测序或高通量测序技术，是指能够一次性并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术。它通过对物种的基因组或转录组进行深入、细致、全貌的分析，为科学研究提供了丰富的基因序列数据。

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NGS技术的基本原理是通过将多个物种的基因组放在同一个板上，然后使用定制的小核苷酸片段进行高通量的序列测定。这些小核苷酸片段会涉及到每个物种基因组序列上的每个核苷酸位点，并围绕这些位点交叉重复出现，形成一个特别的组合。结合这种组合匹配的原则，可以完成整个基因组序列的高通量测定。同时，软件程序也在核苷酸序列本身的分析上发挥重要作用，帮助完成基因组序列的准确测定。

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简而言之，下一代测序是一种高通量的DNA或RNA序列测定方法。与传统的单一分子克隆和序列分析相比，它能够在短时间内批量处理样品、产生数以万计的短读段数据，并依赖高效的算法来进行比对和分析。因此，以低成本、高准确度、高通量和快速检测而成为目前最常用的基因检测手段之一。

NGS的基本流程

一、样品制备

核酸提取: 首先从生物样品(如细胞、组织、血液等)中提取出DNA或RNA。这一步是确保后续测序结果准确性的基础。
纯化:对提取的核酸进行纯化，去除杂质，如蛋白质、盐类、糖类等，以提高核酸的纯度和浓度。

二、文库制备

片段化: 将核酸样品切割成较小的片段，通常是通过物理方法(如超声波处理)或酶促反应(如限制性内切酶或转座酶)进行。片段化的目的是使核酸分子更适合测序仪的读取。
末端修复与加A尾: 对于DNA片段，需要进行末端修复，将不平整的末端修复成平末端，并在3'端加上一个“A”尾。这一步是为了后续与带有“T”尾的测序接头进行连接。

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接头连接: 将特定的测序接头连接到核酸片段的两端。这些接头包含用于测序仪识别的序列，以及用于区分不同样本的索引序列。
扩增: 通过PCR或其他扩增方法，将连接了接头的核酸片段进行扩增，以获得足够数量的模板用于测序。但值得注意的是，扩增次数并非越多越好，因为过多的扩增可能会引入扩增偏倚和错误。

三、靶向捕获(可选)

对于需要特定区域测序的项目，如全外显子组测序或基因组特定区域测序，可以通过靶向捕获技术将目标序列从文库中富集出来。这一步可以大大提高测序的准确性和深度。

四、上机测序

文库加载: 将制备好的文库加载到测序仪的流动池(flowcell)中。
测序反应: 在测序仪中，通过边合成边测序或边连接边测序的方法，对文库中的核酸片段进行测序。测序过程中，测序仪会依次加入带有荧光标记的dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)，并根据荧光信号确定每个位置的碱基类型。
图像捕获与数据分析: 使用高分辨率摄像机捕获荧光信号的图像，并通过生物信息学软件对图像和序列数据进行处理和分析，最终得到测序结果。

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五、数据分析

质量控制: 对原始测序数据进行质量控制，包括去除低质量序列、校正测序错误等。
序列比对: 将质控后的序列与参考基因组进行比对，确定每个序列在基因组中的位置。
变异检测: 通过比对结果，检测样本中的单核苷酸变异(SNV)、插入/缺失(INDEL)、结构变异(SV)等遗传变异。
报告生成: 根据变异检测结果，生成详细的测序报告，包括临床解读、治疗建议等。

以上就是NGS测序的基本流程。需要注意的是，不同的测序平台和实验设计可能会有所差异，但总体流程是相似的。

如何选择合适的NGS平台

选择合适的NGS(下一代测序)平台是一个复杂但至关重要的决策过程，它取决于多个因素，包括研究目标、样本类型、测序深度、成本效益、数据质量以及平台的可用性和技术支持等。目前NGS技术平台主要包括以下几种：

1. 454测序技术

454测序技术是Roche公司开发的一种基于串联合成反应(Sequencing by Synthesis，SBS)的测序技术，利用荧光信号检测DNA合成的过程来实现DNA测序。虽然目前454技术在NGS市场上的份额已经较小，但其仍然在一些特定应用领域有一定的市场需求。

2. Illumina测序技术

Illumina是目前NGS市场上应用最广泛的技术之一。其基本原理是利用DNA合成、扩增和测序的方法来实现高通量的DNA测序。Illumina技术具有高度的准确性、可靠性和通量，适用于全基因组测序、转录组测序、甲基化分析等多种应用。

3. Ion Torrent测序技术

Ion Torrent技术是一种基于半导体芯片的测序技术，采用了无化学荧光标记的DNA测序方法。Ion Torrent测序技术具有简化的工作流程、较短的实验周期和较低的设备成本，适用于小规模实验室和临床诊断应用。

4. PacBio测序技术

PacBio技术采用了单分子实时测序(Single Molecule Real-Time，SMRT)技术，能够实现长读长的DNA测序。PacBio技术具有高度的读长和低错误率的特点，适用于结构基因组学、复杂基因组结构分析等领域。

5. Oxford Nanopore测序技术

Oxford Nanopore技术是一种基于纳米孔测序原理的技术，通过电子信号检测核酸分子在纳米孔中的穿过过程来实现DNA或RNA的测序。ONT技术具有实时测序、便携式设备和长读长等特点，适用于野外环境、迅速诊断和移动医疗等应用。

图片来源：IVD工具人《NGS测序市场发展趋势》

这些主要的NGS技术各自具有特点和优势，适用于不同的实验目的和应用场景。随着技术的不断发展和创新，NGS领域的技术和平台也在不断更新，为科学研究、临床诊断和生物工业等领域提供更加丰富和强大的工具。同时，随着Solexa/Manteia/Illumina专利开始到期，势必对NGS市场发展产生影响，具体影响可能包括：更新的NGS 平台、给Illumina带来试剂定价压力以及使用新试剂开发新(或更新)技术等。

NGS的进步与技术发展

随着技术的不断发展和创新，NGS领域的技术和平台也在不断更新，为科学研究、临床诊断和生物工业等领域提供更加丰富和强大的工具。

1. 测序通量的提升

NGS技术相比传统测序技术，最大的优势在于其高通量。近年来，随着技术的不断进步，测序通量持续提升，能够在短时间内完成大量DNA或RNA分子的测序，大大加快了基因组学、转录组学等领域的研究进程。

2. 测序成本的降低

随着测序技术的成熟和市场竞争的加剧，NGS测序成本显著降低。这使得更多实验室和科研机构能够承担得起测序费用，推动了NGS技术的普及和应用。

3. 测序精度的提高

NGS技术在测序精度方面也不断取得突破。通过优化测序流程、改进测序算法等手段，NGS技术的测序精度不断提高，为科学研究提供了更加准确的数据支持。

图片来源：小桔灯网《NGS的现状、发展及新一代建库解决方案》

总体来说，NGS技术已经从科研走向了临床，成为医疗保健领域的重要工具之一，可帮助人们深入了解基因构成和各种疾病的易感性，通过识别致病变异，实现对癌症、传染病、罕见基因变异、产前异常以及可能影响治疗反应的药物基因变异的早期准确检测，从而大幅改善患者的治疗效果。其中，NGS的技术未来发展：

1. 测序平台的多样化

目前，市场上存在多种NGS测序平台，如Illumina、Thermo Fisher Scientific、Pacific Biosciences等。这些平台各有特色，适用于不同的研究需求。例如，Illumina平台以其高通量、低成本和准确性高而广受欢迎；而Pacific Biosciences平台则以其长读长测序能力著称。

2. 单细胞测序技术的发展

单细胞测序是NGS技术的一个重要发展方向。通过单细胞测序，可以揭示细胞之间的异质性，为疾病的发生、发展和治疗提供新的视角。目前，已有多种单细胞测序技术被开发出来，并在肿瘤学、免疫学等领域得到应用。

3. 长读长测序技术的改进

长读长测序技术能够一次性读取较长的DNA片段，有助于解决基因组中的重复序列和结构变异等问题。近年来，长读长测序技术取得了显著进展，如PacBio Biosciences的单分子实时测序技术，已经能够实现数万个碱基的连续测序。

4. 实时测序技术的进步

实时测序技术能够在测序过程中实时分析数据，提高测序效率和准确性。随着技术的不断进步，实时测序技术将在更多领域得到应用，如传染病监测、肿瘤早期诊断等。

5. 多组学数据整合与分析

NGS技术不仅限于基因组测序，还可以扩展到转录组、蛋白质组、表观组等多组学领域。通过多组学数据的整合与分析，可以更加全面地揭示生物体的生理和病理过程，为精准医疗和个性化治疗提供有力支持。

6. 便携式和微型化POC设备的发展

随着NGS技术的不断发展，便携式和微型化POC(Point-of-Care)设备逐渐出现。这些设备具有体积小、操作简便、成本低廉等优点，可以在现场快速完成测序和分析工作，为临床诊断和治疗提供更加便捷的服务。

撰文 | NIRO

编辑 | 小彭

来源 | 原创，部分内容引用《IVD工具人》与《小桔灯网》

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