⁵ᵐC还是⁵ʰᵐC？甲基化测序

1、重亚硫酸盐测序BS-Seq

1）先建库再转化

在illumina Truseq DNA建库试剂盒当中，其接头上的C已经经过甲基化修饰，因此，用这些接头建库后，在上述转化过程中，接头上的⁵ᵐC不会被转化成U。

在用亚硫酸氢盐处理DNA文库时，90%以上的 DNA链会断掉，文库的丰富度就会损失90%以上。

2）先转化再建库

①单链建库

重亚硫酸氢盐会将dsDNA解链成ssDNA，所以需要进行单链DNA建库。

②EpiGnome甲基化建库

a.用重亚硫酸氢盐处理DNA，将未甲基化的C都转成U。

b.把带标签1的随机引物1加入，进行第一次的复制，得到第1条的复制链。

c.消化掉过量的引物1。

d.加入带末端终止碱基、并带标签2的随机引物 2。从而让第一复制链延伸且加上标签2，同时使 PCR得以正常进行。

e.加入建库的PCR引物，进行PCR。通过PCR，把 Index序列和成簇引物序列加入到链的两侧，得到测序可用的文库。

2、TAPS甲基化测序

3、酶法甲基化测序（EM-seq）

Enzymatic Methyl-seq（EM-seq）通过酶法完成WGBS建库，其对DNA的酶处理分为两步：

第一步使用TET2酶以及氧化增强剂将⁵ᵐC和⁵ʰᵐC氧化成⁵ᶜᵃC，保护经过修饰的胞嘧啶；

第二步利用脱氨酶APOBEC对胞嘧啶进行脱氨处理，此步骤不会对5caC造成影响，从而实现⁵ᵐC和⁵ʰᵐC的检测。

1、氧化亚硫酸氢盐测序oxBS-seq

通过高钌酸钾(KRuO₄)氧化羟甲基化的C，将其转化成甲酰化的5fC。甲酰化的C碱基，可以被重亚硫酸氢盐转化成U；而甲基化的C，不会被转化成 U。这样就把⁵ʰᵐC和⁵ᵐC给区分开来了，可以特异性的检测⁵ᵐC。

研究表明，该反应转化效率是94%左右，同时⁵ᵐC只有 2.1%会被转化成⁵ᶠC。

2、TAPSβ

TAPSβ也是用糖基化酶把羟甲基化的C给保护起来，使其免受TET氧化。

再使用TET酶将甲基化的C转化为羟甲基化的C再转化成甲酰化的C和羧基化的C。

⁵ᶜᵃC则可在吡啶硼烷还原为二氢尿嘧啶，而被保护起来的羟甲基化的C则不变。经过后续步骤测序则可特异性的区分⁵ᵐC。

1、BS-Seq和oxBS-Seq联合测序

可实现对⁵ʰᵐC单碱基分辨率的检测。

2、TET辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq)

①先用糖基把⁵ʰᵐC保护起来，变成⁵ᵍᵐC。

②再用TET酶把⁵ᵐC转变成⁵ʰᵐC，再转化成⁵ᶠC和羧基化的⁵ᶜᵃC。甲酰化的C和羧基化的C都可以被重亚硫酸氢盐转化成U。

③之前被糖基化保护起来的⁵ʰᵐC，则不会被TET 蛋白转化成甲酰化的C或者羧基化的C。在重亚硫酸氢盐的处理过程中，它还保持是C，从而将⁵ʰᵐC和⁵ᵐC区分开来，特异性的检测⁵ʰᵐC。

这个方法，没有甲基化的C，99.6%都被转化成了 U；甲基化的C，97.7%都被转化成了U；而羟甲基化的C，只有8%被化成了U。也就是说本法理论转化效率能达到92%。

知识贴：转化效率和内参

为了对实验的转化效率进行质量控制，一般会在转化实验当中加入内参对照品。

1、阴性内参

利用甲基化酶缺陷型大肠杆菌，通过其所生产的完全没有被甲基化的λ（噬菌体）DNA或者pUC19p-primer-质粒）DNA做内参，来看一次实验当中C的转化效率。

实际操作中，一般会选择加入1%的完全没有甲基化的λ DNA做内参。

2、阳性内参

用CpG岛完全被甲基化的DNA来跟踪甲基化DNA对转化的抵抗效果作为参数。

3、APOBEC偶联甲基化测序(ACE-seq)

该技术使用AID/APOBEC家族DNA脱氨酶APOBEC3A (A3A)代替化学脱氨，保证了DNA的完整性。

首先，利用T4 β-葡糖基转移酶（βGT）将⁵ʰᵐC转化成⁵ᵍᵐC，⁵ᵍᵐC不会被A3A酶脱氨基，这样A3A能够特异地脱去C及⁵ᵐC的氨基使其变为U。

而⁵ʰᵐC则因为不被该酶识别，测序时仍被检测为C，这样，⁵ʰᵐC与C及⁵ᵐC就区分开来，实现特异性检测⁵ʰᵐC。

4、CAPS技术

CAPS仍利用了oxBS-seq中高钌酸钾KRuO₄将DNA上的⁵ʰᵐC氧化成⁵ᶠC，⁵ᶠC也可经吡啶硼烷的衍生物（pic-borane）还原成二氢尿嘧啶，从而实现特异性的检测⁵ʰᵐC。

［1］《陈巍学基因》笔记(12)甲基化测序-珠江肿瘤

［2］干货|DNA甲基化和DNA羟甲基化测序技术及5mC和5hmC测序方法-翌圣生物