抗逆转录病毒联合治疗(cART)已将人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染从致命疾病转变为慢性疾病。尽管cART有效地将循环病毒降低到无法检测的水平，但整合的前病毒仍然存在于免疫细胞中，主要是静止记忆CD4+ T细胞，构成潜伏病毒库。停用抑制性cART可能会促使复制能力强的HIV-1前病毒重新激活，导至病毒反弹。因此，需要终身治疗来维持病毒抑制，并且迫切需要cART以外的干预措施来实现HIV-1的治愈。此外，还需要可靠的、精确的、高通量的含有可诱导HIV-1的感染细胞频率的测定方法。然而，这些细胞的频率很低，估计在每百万CD4+ T细胞中有1到1000个，这使得定量分析极具挑战性。 近日，杂志Communications medicine上发表了一篇题为“Specific quantification of inducible HIV-1 reservoir by RT-LAMP”的文章。作者提出了一种基于RT-LAMP的SQuHIVLa检测方法，用于检测表达tat/rev msRNA的细胞。作者设计了LAMP引物/探针组，专门用于高灵敏度和高特异性检测HIV-1亚型B和C的tat/rev msRNA，同时确保前病毒DNA不会扩增。最后还利用SQuHIVLa在具有不同临床特征的PLWH CD4+ T细胞中成功量化了表达tat/rev msRNA的细胞的频率，作为可诱导HIV-1病毒库大小的替代标记物。因此，SQuHIVLa为准确评估潜伏HIV-1病毒库的大小和诱导性提供了一个强大的工具，这对于评估潜在HIV-1治愈干预措施的有效性至关重要。 图片来源：Communications medicine 主要内容 检测原理 msRNA属于细胞相关HIV生物学标志物，在监测和预测治疗有效性及病毒持续存在程度方面有较大的应用价值。在未表达病毒的CD4+T细胞中，msRNA被滞留在细胞核中，阻止Tat和Rev调节蛋白的翻译，促进了HIV潜伏状态的发生。而当潜伏细胞受刺激激活后，msRNA才出现于潜伏细胞中。因此测定细胞相关msRNA可预测未治疗患者疾病进展、病毒复制以及在抗病毒治疗过程中病毒库大小。由于tat/rev msRNA转录本是在全长病毒转录本剪接后产生的，它们被发现是潜伏期后病毒复制的一个有意义的指标。 LAMP引物/探针组 专为检测HIV-1 tat/rev msRNA而设计 作者首先设计LAMP引物/探针组用于特异性LAMP检测HIV-1 tat/rev msRNA。以HIV-1 B亚型为例，创建tat/rev HIV-1 DNA一致性序列。使用PrimerExplorer V5软件生成初步的LAMP引物集。选择具有外显子跨越结合区域的引物，以避免包含内含子的基因组DNA扩增。生成环引物，并选择适合转化为自猝灭探针的引物。所选的引物必要时进行修改，以最大限度地减少突变热点的影响。选择符合所有标准的引物，在引物集最终用于SQuHIVLa之前进行各种实验验证。 RT-LAMP检测tat/rev msRNA的 高灵敏度和特异性 作者评估了RT-LAMP检测tat/rev msRNA的敏感性，结果显示在>97%的反应中，RT-LAMP可在30分钟内检测到低至50个RNA拷贝数，LOD-95%为31拷贝(图b, d, e)。当RNA拷贝数较低时，RT-LAMP的效率降低，导至获得结果的时间较长，反应之间的变异性增加，尽管所有阳性扩增都在90分钟内实现(图c)。 随后，为了确定RT-LAMP直接从细胞中检测tat/rev msRNA的敏感性，作者使用了J-Lat 11.1细胞，具有可诱导的全长HIV-1基因组。在没有CD4+ T细胞背景的情况下，95.83%的RT-LAMP反应中检测到单个GFP+细胞，在2x104个细胞背景下，阳性率下降到83.33%，但对RT-LAMP扩增时间没有显著影响。 在另外一系列的验证实验中，作者证明了RT-LAMP可特异性扩增tat/rev msRNA，避免了基因组DNA的同时扩增。总的来说，作者证明了RT-LAMP对表达tat/rev msRNA的细胞的快速、敏感和特异性检测，并试图使用该试验来定量可诱导的HIV-1库，以下称为SQuHIVLa。
SQuHIVLa中RT-LAMP检测msRNA的灵敏度。 图片来源：Communications medicine 使用SQuHIVLa精确和可重复地 定量表达tat/rev msRNA的细胞频率 作者生成了四个模拟HIV-1测试样本，包括活化的GFP+ J-Lat 11.1细胞(0.1、1、10和20细胞)，分配到100万个CD4+ T细胞背景中。结果显示，频率大于20个GFP+细胞/百万CD4+ T细胞时，预测的病毒库大小测量高度精确，变异系数(CV)为6.61%。在0.1个细胞GFP+细胞/百万CD4+ T细胞时，CV增加到60.61%(图d)。预测的病毒库测量结果具有良好的准确性，对于库大小大于1个GFP+细胞/百万CD4+ T细胞，平均准确率(AP)为85%(图e)。 作者应用该方法量化原代CD4+ T msRNA+细胞的频率，以进一步验证SQuHIVLa。作者优化了孵育温度和时间以促进更有效的RNA释放。结果显示使用来自三个PLWHB的CD4+ T细胞进行的三个独立的SQuHIVLa实验确定了CV为9.58%，表明SQuHIVLa在量化可诱导的HIV-1库时具有高重复性(图h)。
使用SQuHIVLa定量分析可诱导的HIV-1病毒库。 图片来源：Communications medicine SQuHIVLa对非b型HIV-1亚型的适应性 作者设计了一套特异性扩增C亚型tat/rev msRNA的 LAMP引物和探针。在>97%的反应中检测到50拷贝tat/rev HIV-1 C亚型 msRNA(图b)，平均扩增时间为38.19 min(图c)。所有阳性扩增均在90分钟内完成， LOD-95%被确定为45个拷贝(图d, e)，与对B亚型的观察结果一致。 评估了SQuHIVLa在19例PLWHC的临床样本中的表现。在所有样本中均检测到tat/rev msRNA，表达tat/rev msRNA的细胞频率范围为每百万CD4+ T细胞10.12至98.08个细胞(图g)。在慢性感染的PLWHC中，女性(n = 10)表达tat/rev msRNA的细胞频率明显高于男性(n = 7) (P = 0.0202)(图i)。总体而言，这些发现表明SQuHIVLa具有高度适应性，并且在涉及具有各种临床特征的HIV-1患者的研究中具有很大的应用潜力。
SQuHIVLa的设计和应用来量化HIV-1 C亚型患者的可诱导病毒库。 图片来源：Communications medicine 总结与讨论 作者开发了SQuHIVLa方法，利用RT-LAMP的高灵敏度和特异性，在单管反应中检测和定量激活后表达tat/rev HIV-1 msRNA的细胞。SQuHIVLa中使用的LAMP引物/探针专门用于检测HIV-1 tat/rev msRNA，并适用于不同的HIV-1亚型。作者成功地量化了cART HIV-1 B和C亚型感染者CD4+ T细胞中的可诱导病毒库。该试验具有高灵敏度、特异性和重复性。 未来的研究应侧重于评估撒哈拉以南非洲地区的大量人群，那里承受着不成比例的HIV-1负担。这强调了在资源有限的情况下进行病毒库定量分析的必要性。RT-LAMP具有高灵敏度，更便宜，更用户友好，并与各种样品类型兼容。这些特点使RT-LAMP成为HIV-1分子诊断和病毒载量监测定量分析的有前途的工具，特别是在资源有限的情况下。然而，RT-LAMP方法也存在一些局限性：首先，LAMP的复杂性提高了，特别是在引物设计中。同样，由于潜在模型假设和参数的不确定性，在精确估计真实病毒库大小方面面临挑战。总之，SQuHIVLa为准确评估潜伏HIV-1病毒库的大小和诱导性提供了一个强大的工具，这对于评估潜在HIV-1治愈干预措施的有效性至关重要。 |
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