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当磁珠加了基团,犹如给理想插上了翅膀

2024-6-25 14:51| 编辑: 归去来兮| 查看: 626| 评论: 0|来源: 基因学习笔记

摘要: 磁珠便开始在生物的世界里翱翔


当普通磁珠加了基团,犹如给理想插上了翅膀,磁珠便开始在生物的世界里翱翔。


生物磁珠是由高分子聚合物与无机磁性纳米粒子形成的磁性微球。既具有机高分子材料的易加工和柔韧性,又具有无机材料的高密度和高力学性能。


因其具有磁性,可在外加磁场的作用下方便地被定位、导向和分离,因而可以用于高效分离生物分子。


生物磁珠的特性

高比表面积。纳米材料随着粒径变小,其表面积、表面能及表面结合能都迅速增大,表面原子所占的百分数会显著增加。表面原子周围缺少相邻的原子,有许多悬空键,具有不饱和性,易与其它原子结合而稳定下来,表现出较高的化学活性。

磁响应性。磁响应性即磁性微球对外加磁场的反应。磁性微球中磁核的含量是反映微球磁响应性的一个重要参数,当作为磁核的金属氧化物粒子的直径小于 30nm 时,具有超顺磁性,即在磁场中有较强的磁性,当有外加磁场时,磁性微球将携带核酸或者其它生物大分子快速定向运动,达到分离纯化的目的。 

功能基特性。包覆磁性微粒的高分子材料携带多种具有反应活性的功能基团如-OH、-COOH、-CHO、-NH2、-SH 等,通过这些功能基使磁珠具有不同的特性,可用于细胞分离、核酸杂交、免疫沉淀等领域。 

生物相容性。多数生物高分子如多聚糖,蛋白质类具有良好的生物相容性。它们在人体内安全无毒,可降解,不与人体组织器官产生免疫性,这种性质使其在生物工程中有良好的应用前景。

磁珠结构

核-壳型结构:核为磁性纳米粒子,壳为高分子聚合物或无机纳米材料,如硅羟基磁珠表面为二氧化硅基质,内部包裹磁性纳米颗粒,表面修饰大量硅完醇基团(羟基),主要应用于核酸提取。 

夹层式结构:即内核为聚合物微球,第二层为磁性纳米颗粒,第三层为功能高分子聚合物涂层。比如片段筛选磁珠的最内层核心是聚苯乙稀微球、第二层包裹磁性物质四氧化三铁,最外层表面是羧基修饰的高分子材料。表面修饰功能团多样,如羧基,氨基,protein A/G 和链霉亲和素等,应用于生物素捕获,免疫分析、细胞分选等。 

弥散型结构:磁性颗粒弥散地分布在聚合物的基体中而形成的磁性复合微球。多以天然琼脂糖为基质,由于其具有丰富的多孔结构,因此载量很高。将其表面修饰有羟基、氨基或羧基功能基团,可用于蛋白质的固定。表面亦可修饰为金属离子,GSH,Strep-Tactin,DEAE,protein A/G等,常用于蛋白分离纯化。

磁珠的应用领域

核酸提取纯化

核酸能够在水溶液中稳定分散不沉淀,是由于三种非共价作用力的存在:静电相互作用、范德华力和氢键。核酸分子具有多个磷酸基团,呈现高度负电性,分子间因为静电作用互相排斥从而避免发生团聚。此外,核酸分子在水溶液中通过氢键与范德华力结合了大量的水分子在其周围,形成一个水化层,也阻止了分子间的聚集。要使得核酸分子结合到磁珠表面,需要削弱这些作用力,屏蔽溶液中的静电斥力,同时破坏核酸分子表面的水化层,使其能够与磁珠表面相接触,进而产生吸附。

商业化磁珠产品体系一般包含:磁珠、聚乙二醇(PEG)、盐离子等。基于SPRI(Solid Phase Reversible Immobilization )技术, DNA在一定浓度的PEG存在条件下,NaCl或MgCl2促进条件下,DNA分子构象会发生急剧变化,会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团,与表面带负电荷的羧基磁珠结合。目前认为这种负负电荷间的作用是由于带正电荷的盐离子的作用(如Na+)。带负电磷酸基团借由解离的盐离子(如Na+)与羧基形成离子桥,使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。利用磁珠的磁性,可通过外加磁场进行收集洗脱。

硅羟基磁珠是使用最为广泛的核酸提取磁珠。使用硅羟基磁珠提取核酸时,通常需要高浓度的离液盐(如盐酸胍、异硫氰酸胍、高氯酸钠和碘化钠等)。高浓度的盐离子能够有效屏蔽溶液中的静电斥力。同时,离液盐离子还能竞争性地与磁珠表面以及核酸分子相结合,破坏二者表面原有的水化层,促使磁珠与核酸分子通过氢键和范德华力相互靠近吸附。由于常用的离液盐如胍基离子对PCR有抑制作用,因此它们必须在后续的洗涤步骤中被去除。

羧基磁珠也可通过加入高浓度离液盐,吸附核酸分子;此外,还可通过加入不同浓度的聚乙二醇(PEG)和NaCl,实现不同核酸片段的筛选。核酸分子在一定浓度的PEG和NaCl中,会发生脱水反应,分子构象急剧变化,由线状蜷缩成小球状,继而聚集沉淀,同时暴露出磷酸骨架上带负电荷的磷酸基团,借由解离的盐离子(如Na+)与磁珠表面的羧基形成离子桥,使核酸被吸附至磁珠表面。而且,核酸分子量越大,越倾向于与磁珠结合,因此,通过调节溶液与核酸样本的体积比,则可促使较大分子量的核酸片段优先吸附于羧基磁珠表面,从而对核酸片段进行筛选。


PEG的作用:1) PEG具有醇的化学性质,能破坏核酸分子的水化层,诱导核酸分子的聚合和沉淀;2) 增加溶液的粘稠度,让磁珠保持悬浮不容易沉聚,在结合过程中更充分与DNA接触;3) PEG的DNA沉聚效果容易收到pH、温度等的影响;温度过低PEG也不易与水完全互溶,所以磁珠一般都要求室温平衡后再用,其储存buffer里也会加一些低浓度的pH稳定剂,如Tris-HCl等。

DNA越长,表面裸露出来带负电的磷酸基团越多,整条分子带的负电就更强,更容易吸附到磁珠,只需要较低浓度的PEG和NaCl,就可以回收;DNA越短,就需要更高浓度的PEG和NaCl,将其表面的水化层破坏得更彻底,裸露出来足够多带负电的磷酸基团,才能被磁珠吸附住,从而回收回来。所以如果想回收较短的DNA片段时,需要加入的磁珠体积更大。         

双链DNA、单链DNA,RNA都可以在溶液中解离出带负电的磷酸基团,因此都可以用磁珠进行纯化回收,但单链DNA和RNA都没办法进行片段大小筛选。双链DNA的二级结果一般是一条较稳定的线性双螺旋分子,在PEG的存在下,解离出来带负电的磷酸基团多少和其长度正相关,而RNA和单链DNA,二级结构比较复杂,导至其裸露出来的负电基团无法跟长度呈正相关,所以没办法像DNA那样进行片段筛选。RNA和DNA在不同pH下稳定性不一样,所以纯化RNA的磁珠buffer中pH和纯化DNA的磁珠是不一样的。

Oligo dT磁珠表面共价修饰了Oligo(dT)序列,其可以和mRNA的polyA尾之间的碱基配对(真核细胞的mRNA具有3''端poly A的结构),因此可以从真核总RNA或者细胞、动植物组织等多种样本中快速分离纯度高且完整的mRNA。样本中较多的杂质(比如多糖、蛋白质和长链DNA等)均会导至磁珠聚团,另外样本起始量过多,超过了磁珠的载量也会导至磁珠聚团,磁珠聚团会降低mRNA得率和纯度。

液相杂交捕获测序

链霉亲和素磁珠表面官能团为链霉亲和素,可以特异性地结合生物素标记分子,进而分离生物素化分子。(一分子链霉亲和素结合四分子生物素,二者之间的相互作用是自然界已知最强的非共价结合力之一)。液相杂交捕获原理,即携带生物素的探针与靶标区域互补杂交,后结合到链霉亲和素磁珠上实现捕获,其他片段被洗脱,随后经变性将探针与目标片段分开,磁分离去除磁珠及结合在上的空探针,即完成目标区域的捕获。


免疫分析  

磁珠在磁场作用下实现结合、未结合蛋白快速分离,简化操作,缩短反应时间。磁珠表面通过外部修饰的功能基团结合活性蛋白,作为抗原抗体反应的载体。磁珠作用方式分为直接作用和间接作用两种,直接作用是用抗体/抗原包被磁珠直接与特异性抗原/抗体物质结合后,形成磁珠-免疫复合物。间接作用是用二抗包被磁珠,抗原与一抗进行孵育,再加入二抗偶联的磁珠,形成磁珠-二抗-一抗-抗原复合物。复合物具有强磁响应性,在磁力的作用下定向移动,使复合物与液体中其他物质分离,达到分离、浓缩、纯化特异性蛋白的目的。    

蛋白质或抗体偶联磁珠表面的稳定性主要取决于表面性质。当磁珠表面无修饰时,抗体通过疏水相互作用被动吸附到磁珠表面。这种方式不能控制附着分子的最终方向,也无法保证捕获分子的特异性和稳定性。为确保偶联稳定性与捕获特异性,可选择化学修饰表面与生物修饰表面。

化学修饰表面:

①经典化学修饰表面:抗原或抗体直接被动吸附于化学修饰磁珠表面。活性基团利用磁珠的表面积为抗原或抗体提供大量位点,使其与磁珠共价连接。添加到表面的经典基团有羧基、氨基、羟基。

② 预活化修饰表面:分子连接到表面预活化修饰磁珠之前无需进行初步激活,在适宜缓冲液、pH和温度条件下即可形成稳定共价偶联。

生物修饰表面

与化学修饰不同,生物修饰以非共价方式连接分子。

① 蛋白A或G以非常高的亲和力结合某些免疫球蛋白亚型。蛋白A结合大多数Ig的Fc区,蛋白G结合Ig的Fc或Fab区,可用于固定抗体;

② 链霉亲和素具有极高亲和力,链霉亲和素与生物素之间的结合可承受高温、大范围pH值等极端条件。

细胞分选

磁珠细胞分选技术(MACS)是基于磁珠上的官能团,直接或间接地与细胞表面配体相互识别作用后,进行特异性捕获分离。用于细胞分选的磁珠多为免疫标记磁珠,即磁珠上直接或间接耦联抗体,与目标细胞表面抗原特异性识别。在外加磁场的作用下将磁珠标记的细胞与其它细胞分离,从而实现目的细胞的富集和纯化。   


根据目标细胞是否直接被磁珠捕获后分离获得,可分成正选和负选两种方法。


正选:是指目标细胞被磁性标记后,通过磁性分离直接分选出被捕获的目标细胞,该方法也称为阳性分选。


首先,磁珠直接或间接与目标细胞结合,使得目标细胞标记上磁性;通过外加磁场将目标细胞吸附固定,非目标细胞等杂质存留于液体中可被除去;加入洗脱液洗脱细胞,即可收集到目标细胞。正选方法只需用一种抗体标记的磁珠便可获得纯度较高的目标细胞,操作简单直接,但最后洗脱获取的目标细胞上标记有磁珠,可能对细胞有一定激活作用,致使下游应用受到影响。



负选:将磁性标记于非目标细胞上,通过磁性分离去除非目标细胞,而收集的上清液则包含目标细胞,该方法也称为阴性分选或去除分选。


在非目标细胞上标记磁性,使其在磁性分离时被固定,而目标细胞则留存于上清液中,可被收集获取。负选获得的目标细胞未被磁珠标记,无需去除磁珠,但为去除非目标细胞,需使用多种抗体标记的磁珠,成本相对较高。


磁性转染

磁转染技术将磁性颗粒和某些生物大分子通过化学共价键或物理粘附作用相结合,形成具有磁响应性的微粒。然后通过磁性微粒的表面基团与传统的病毒或非病毒载体耦联,再与目的基因相结合,构成载附基因的磁性微球。在外加梯度磁场的作用下,磁性微球会随着磁场力的导向集中于靶位器官或组织。在细胞的胞吞作用下,磁性微球进入细胞内,目的基因释放。  

 


肿瘤磁热治疗

磁热治疗(magnetic hyperthermia,MH)是热疗的一类方法,它通过利用磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)在高频交变磁场下转换为热能,提高局部病灶部位组织温度(42℃以上),诱导肿瘤细胞凋亡。且当外磁场撤去,MNPs可经血液循环进入肿瘤相关部位或者被肝、脾及淋巴结等处的吞噬细胞系统识别被机体清除,相比其他的热疗法如射频、微波等,磁热疗法具有安全性高,不良反应少,可充分加热肿瘤,同时生物组织对磁场强度影响小等优点,为恶性肿瘤的治疗提供了新的方向,实现了分子水平的精准热疗。


参考资料:

干货分享 | 初识生物磁珠 - 企业动态 - 丁香通 (biomart.cn)

磁珠种类、结构_化学发光免疫磁珠作用原理及应用_欧凯生物 (okaybio.com)

“ 核酸 ” 和 “ 磁珠 ” 的故事 (qq.com)

基于磁纳米材料的磁热疗抗肿瘤研究进展 - 中华放射肿瘤学杂志 (yiigle.com)


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