PCR、Real-Time PCR、RT-PCR、qRT-PCR基本原理及适用范围介绍

1 聚合酶链式反应反应（PCR）

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，已成为生物科学、诊断学和法医学最有价值的生物技术之一。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）可以将非常少量的 DNA 转化为非常大量的 DNA，是许多分子生物学专业技术基础[1]。尤其在水生热菌（Thermus aquaticus）中引入热稳定的DNA聚合酶，该技术的自动化和改进取得了进展，因此得名Taq DNA聚合酶 [2]。PCR技术在生物领域广泛使用，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对[3]。 普通PCR即第一代PCR技术，以双链DNA为模板，以dNTP为底物，特异性地扩增双链DNA，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。

（图1 PCR循环需要基本材料以及一个循环实现基因扩增）

在PCR的循环中一般经历“变性→退火→延伸”的流程之后，靶基因（双链DNA）数量由n变成了2n；2次之后是4n条；以此类推，经过变性、退火和延伸重复若干个循环后，实现靶基因扩增放大几百万倍。扩增完成之后对扩增出来的DNA进行检测，例如凝胶电泳手段（鉴定大小），测序（鉴定靶基因序列）。

2 Real-Time PCR

实时聚合酶链式反应（Real time-polymerase chain reaction,RT-PCR）核酸扩增和检测技术是当今生物学研究中最有价值的工具之一。生命科学各个领域的科学家——基础研究、生物技术、医学、法医学、诊断学等等——在广泛的应用中利用这些方法。实时PCR(RT-PCR)是一种使用荧光染料或探针（实验室通常称为引物）技术对样品中存在的核酸进行定量的技术或实现靶基因/序列的扩增。RT-PCR足以扩增目标是模板DNA (cDNA是其中一种)，也就是说，它可以在PCR仪器（热循环仪器）复制DNA。它使我们能够研究目标序列或基因，因此一直是遗传学中的一项关键技术。

（图2 RT-PCR扩增目的片段步骤简易示意图）

（图3 RT-PCR热循环扩增目的片段步骤简易示意图）

3 Reverse transcription-polymerase chain reaction

逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)，一般用于mRNA合成双链的cDNA用于后期的靶基因扩增。逆转录酶PCR (RT-PCR)是扩增靶RNA的聚合酶链反应的一种变体，在PCR之前添加逆转录酶(RT)酶使扩增和检测RNA靶标成为可能。逆转录酶转录模板RNA并形成互补DNA (cDNA)。单链cDNA通过DNA聚合酶转化为双链DNA。这些DNA分子现在可以用作聚合酶链反应的模板。

DNA是单链还是双链得根据实际情况，例如RT-PCR, 3'或5' RACE，我们只使用单链cDNA(第一链cDNA)，其它情况如构建表达载体，qRT-PCR等是双链。一般情况下，cDNA它是在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链（可以参见转录试剂盒的说明书），但是与基因组的DNA复杂序列不一样，因为cNDA来自于mRNA，因此cDNA只有外显子，因为mRNA是通过DNA转录而来，内含子序列或者绝大部分内含子序列已经被丢弃（这原理就是mRNA的剪切作用）。

（图4 逆转录PCR（RT-PCR）合成cDNA示意图）

4 qRT-PCR

定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction），也称为qRT-PCR，用于检测和定量RNA。在qPCR中，扩增产物的数量在每个PCR反应周期使用荧光值被测量。利用的底物或者模板是cDNA(complementary DNA, cDNA)，而cDNA是Total RNA（总RNA）或mRNA首先转录合成。然后将cDNA用作qPCR或实时PCR反应(qPCR)的模板，RT-qPCR用于多种应用，包括基因表达分析、RNAi验证、微阵列验证、病原体检测、基因检测和疾病研究等，是非常常见和通用的一种生物科学实验技术。

实时定量反转录PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR)是PCR技术的一项重大发展，它能够对PCR过程中每个周期产生的产物进行可靠的检测和定量检测。在引入寡核苷酸探针（qPCR引物）后，使得这种技术成为可能，寡核苷酸探针被设计用于在目标序列内杂交。由于Taq聚合酶的5'核酸酶活性，在PCR过程中探针的切割可以用来检测目标特异性产物的扩增。

对于qRT-PCR称呼有不同的形式，但总体上来说，实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR）可能精细一些，毕竟qPCR仪器在采集数据的时候就是一种实时荧光数据收集，当然并不否认定量逆转录聚合酶链反应的称呼是错误的。

（图5 qRT-PCR检测基本原理图）

5 PCR、qPCR、RT-PCR和qRT-PCR小结

PCR、qPCR、RT-PCR和qRT-PCR四种技术都是基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的技术，主要区别在于它们的应用领域和检测目标不同。PCR作为第一代技术主要用于体外靶基因（DNA序列）扩增和检测；qPCR可以实时定量检测DNA或cDNA的含量；RT-PCR基于mRNA合成的cDNA，实时监测并扩增获得靶基因（DNA序列）用于后续实验，属于PCR二代技术范畴；而qRT-PCR技术是RT-PCR和qPCR的技术结合体，实现mRNA的定量分析。

参考文献：

[1] Waters DL, Shapter FM. The polymerase chain reaction (PCR): general methods. Methods Mol Biol. 2014;1099:65-75. doi: 10.1007/978-1-62703-715-0_7. PMID: 24243196.

[2] Lorenz TC. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. 2012 May 22;(63):e3998. doi: 10.3791/3998. PMID: 22664923; PMCID: PMC4846334.

[3]https://baike.baidu.com/item/%E8%81%9A%E5%90%88%E9%85%B6%E9%93%BE%E5%BC%8F%E5%8F%8D%E5%BA%94/555320