作者：高志磊
PCR技术一问世就开启了它的爆炸式发展，该项技术开始在全球范围内的实验室中被广泛使用，成为了生物学和医学研究中最常用的工具之一。1984年，Cetus公司做出了一个非常明智的决定，联合Mullis对PCR技术申请了专利，并撰写了文章发表。1985年，Mullis所在的Cetus公司获得美国专利局授权专利。同年Cetus与Perkin-Elmer公司成立合资公司（简称PE -Cetus），该公司开始利用PCR核心专利，研究和生产DNA热循环仪（PCR仪）。根据协议，Perkin-Elmer占了决定性的51％。请大家记住正是这个极为明智的51%，奠定了后来一家巨头笑傲PCR江湖20年的基础。在1986年，Cetus公司推出了PCR原型机，并授权Roche公司进行生产和销售（授权Roche未查到更多信息，但原型机确实是Cetus开发的）。1987年，PE-Cetus公司研发的世界上第一台商业化量产PCR仪--TC1诞生！TC1 热循环仪的冷却系统由冰箱压缩机和铝制样品块内的管道组成，使用了早期加热元件，开发了一种样品块温度控制算法，以实现准确的控制样品反应模块的温度，从而实现PCR反应。- 实现了 DNA样品在不同温度之间的自动切换，不需要手工在3个水浴锅之间来回移动
- 使用金属块加热和冷却样品，将样品精确地调整到一个温度，同时还能对仪器进行编程，在不同温度之间进行循环
随着第一台PCR热循环仪的发明，PCR实验操作实现了自动化，随之一众苦哈哈的PCR实验员被公司扫地出门……（这是一个悲伤的故事）而此时Mullis已经从Cetus公司离职2年之久了，他此时可能正在享受学术名人带来的光环效应，担任多家公司的科学顾问，经常在世界各地的大学校园、公司和学术会议上发表讲话。得益于耐高温DNA聚合酶和PCR仪这两大法宝，PCR技术得到了迅速的普及和运用，一些眼光毒辣的巨头嗅到了蕴含其中的巨大商机。1991年12月，Hoffmann Roche据称以三亿美元购得了Cetus的PCR技术专利，获得全权开发权，并将Cetus改编为Roche旗下一个新的部门：Roche Molecular Systems。Cetus被吞并，慢慢成了历史，但作为第一个将PCR技术商业化的公司，一直为后来者所敬佩，之后还为行业输送了许多人才，贡献颇多，也算完成了自己的历史使命。由于Perkin-Elmer公司那决定性的51％，Roche不得不与Perkin-Elmer达成协议：Roche掌握方法专利，Perkin-Elmer则保留了仪器研发专利。2023年5月，PE分拆其生命科学与诊断业务，并更名为Revvity，中文名为瑞孚迪1993年，Perkin-Elmer收购Applied Biosystems，几经整合，Perkin-Elmer部分业务被分拆出去，而PCR业务和有关专利留在了Applied Biosystems（ABI）。ABI如今已被赛默飞收入囊中，成为其基因业务线的重要王牌之一对于PCR这样一个应用如此广泛的技术，Roche和ABI各自掌握了一大把专利：ABI有关PCR的专利达40多项，Roche则有超过800项PCR相关专利。近900项PCR专利技术严密布局在PCR仪研发和PCR试剂耗材相关领域，牢牢封锁着仪器研发的命脉，小玩家想进入这一细分，难！至此，罗氏和ABI（赛默飞），两大PCR巨头诞生。三、二代PCR（qPCR）：伯乐通过收购和授权，形成三足鼎力的局面PCR技术具有巨大的利润。1992年，与Cetus公司合作的PE仅在欧洲的销售额就达2500万美元。面对巨额利润的诱惑，谁不动心？于是，各大公司开始了这场持续时间达二十年的PCR核心专利争夺战。1989年，Cetus与化工巨子杜邦公司对簿公堂，对PCR技术究竟是否Khorana先提出并公布、是否公共知识产权进行了激烈辩论。在美国专利局支持下Cetus最终获胜，杜邦被迫黯然退出这个领域。（关于Khorana是否拥有PCR的发明专利，请移步DNA复制的艺术-上，相信大家自有判断，将深刻体会到知行合一的重要性，否则行百里者半九十）这里需要提及另一家公司——MJ Research。1988年MJ Research发布了第一款基于半导体帕尔帖 (Peltier)效应的PCR仪--PTC-100，新型帕尔帖加热和冷却技术因创新性和多功能性而赢得广泛的声誉。原汁原味的PTC-100，MJ出品，注意与被Bio-Rad收购后的PTC-100外形上区别很大，机身前部有MJ的logo1998年，ABI和Roche起诉MJ Research公司故意侵犯PCR专利权，起诉原因是MJ Research故意引导其用户侵犯ABI和Roche PCR专利权。这场官司来来回回打了16年，期间有ABI和罗氏的起诉，也有MJ公司的不断反诉。不过胳膊还是拧不过大腿，2004年，美国陪审团最终判定MJ支付ABI和Roche 1980万美元的损害赔偿金，且日本和德国等发达国家随后纷纷禁止生产和销售MJ公司的产品。MJ元气大伤，随后申请了破产保护，最终宿命是被伯乐收购——另一家大佬以收购形式登场。收购之后推出了新版的PTC-100和PTC-200（DNA Engine），白色、黑色都有，前部外观有好几种，有的标注Bio-Rad的logo，有的有MJ logo，有的写明型号，有的没有型号，大概率是处于新旧交替产生的混乱，产品辨识度一度很抓狂。Bio-Rad中国在2023年发起了<基因江湖征集令，寻找那些年我们用过的PTC>的有奖征集活动，收集到一些至今仍在客户端使用的PTC-100和PTC-200。客户的真实评价是：实验室里最皮实耐用的PCR 仪，服役超20年依然宝刀未老！收购MJ的伯乐因为一直想要进入PCR仪器研发领域，所以不断惹怒ABI 和罗氏，官司缠身。终于在2006年，罗氏、ABI与伯乐达成和解协议，伯乐对罗氏和ABI进行了赔偿，伯乐公司也被授权使用PCR技术进行商业研发。笔者猜测之所以和解，部分原因是因为MJ公司确实发展了PCR技术，有自己独到的解决方案，比如帕尔帖效应精准调控升降温，手中有反击专利大棒的武器，另外MJ公司的产品性能和质量十分优秀，深受市场欢迎。总之伯乐通过收购进入这一细分，两大巨头变三巨头。在后期很长一段时间， ABI、罗氏、伯乐三分天下，令其他想要切入的PCR玩家望而生畏。PCR技术发明专利的有效期为20年，所以在2005年，一批核心专利大规模的到期。2017年，罗氏最后一批PCR核心专利到期，为广大后入局的厂商敞开大门。很多现在很知名的生命科学大佬都是经过ABI授权获得PCR仪研发能力，如凯杰和Eppendorf。但光靠授权还是很难干过ABI，所以，还需要同行另辟蹊径，勇于创新。看到这里，很多读者可能疑惑，除了专利门槛之外，为什么只有ABI、Bio-Rad和Roche三家最后胜出，成为了巨头？这其实主要还是依靠技术创新带来的领先产品满足了基因研究的各种需求，并在各个细分市场形成各自的品牌影响力，最重要的产品是荧光定量PCR仪，即qPCR仪，这才是这三位大佬市场地位和话语权的最大底气。当然随着技术的进步，也出现了digital PCR这个绝对定量利器。限于篇幅，本篇主要聊聊qPCR技术的发展史，下篇聊qPCR市场格局和未来发展方向，这可能是大家太习惯了而往往忽略的领域，而digital PCR由于Bio-Rad一家独大，Qiagen后来居上，其他后来者的发展脉络清晰可查，感兴趣的同行可以自行搜索学习。一代PCR技术基于PCR终点法，有很大的局限性，主要存在三个问题：- 不能定量初始浓度，对很多需要定量的实验或检测束手无策；
- 对扩增产物分析时需要开盖处理，容易造成气溶胶污染；
- 操作步骤繁多，如PCR扩增、制胶跑胶、显像等，实验耗时长。
20 世纪 90 年代中期，随着PCR 技术逐渐成熟，许多科学家都在努力开发利用PCR技术进行定量的方法。当时许多人尝试所谓的终点定量法，这种方法试图根据最终扩增产物的定量来确定起始目标浓度，但PCR的某些特征使其困难重重：- 主要的困难是，PCR 通常会达到一个平台期，在这一阶段，指数扩增停止，几乎没有新的产物。因此，所有起始靶标在平台期的产物浓度都是相似的。实际上，如果PCR达到平台期，就无法准确量化起始靶标的浓度
- PCR与任何酶驱动反应一样，对反应抑制很敏感。许多生物样本和核酸纯化方法都存在已知的 PCR 抑制剂（如血液中的血红素）
对于许多希望获得半定量核酸数据的科学家来说，带有放射性探针的Southern 和Northern印迹是他们的首选方法，但这些方法也有其固有的缺陷。5.3 新的想法开始涌现：促成了qPCR技术的发明大卫-盖尔凡德（David Gelfand）和帕姆-霍兰（Pam Holland）以及 Cetus 公司的同事发现了DNA聚合酶的5′-3′核酸酶活性，以及可以利用这种活性降解 PCR 中杂交探针的方法。他们将之命名为 "TaqMan"，以纪念最早的电子游戏之一 "吃豆子（Pacman）"。在Mullis被授予1993年诺贝尔PCR奖的大约相同时间，Higuchi等人发现（曾就职于 Cetus 公司，后就职于罗氏公司），可以通过添加与扩增的PCR产物相结合的荧光标记来监测PCR过程，随着PCR产物浓度的增加，荧光信号的强度也增加，从而实现 PCR 产物的 "同步扩增和检测"。当时他采用的染料是EB（溴化乙锭）进行荧光信号积累，每个循环读取一次荧光信号，这一发现为现代版的实时荧光定量PCR（qPCR）铺平了道路。qPCR技术的发明者——Russ Higuchi，这次的发明权没有争议ABI 公司的Ken Livak及其同事描述了在 5′-to-3′ 的PCR检测方法中利用荧光能量转移产生探针降解后发出信号系统的现象。之后经过不断的研究，商业公司将以上技术进行整合（主要是Roche和ABI），再通过分析PCR反应中的数学函数关系，建立了Cq（Ct）值与初始浓度之间的算法，在实验中使用已知浓度的标准品，就可以对待测样品中的靶标基因进行准确定量。5.4 PCR 设备也取得了重大进展：实时检测PCR扩增产物1996年ABI（当时属于PE）推出世界上第一台定量PCR仪7700。设备由荧光定量系统和计算机组成，通过荧光染料或荧光探针，对PCR产物进行标记跟踪，结合相应的软件对结果进行分析，可以实现计算待测样品的初始模板量。鲍勃-沃森（Bob Watson）领导的罗氏（Roche）小组开发出了一种可捕获实时EtBr荧光的PCR 热循环仪。由 Carl Witwe 和Kirk Ririe独立开发了一种基于毛细管的快速热循环仪，大大缩短了PCR反应所需的时间。关于Carl Witwer这位天才大神必须要展开介绍一下，他对qPCR技术发展和仪器开发的做出了巨大的贡献：由于Carl Witwer所在的病理系有第三方参考实验室业务，他知道缩短检测时间的重要性。于是他开始研究怎么加快PCR的速度，但买不到现成的快速PCR仪，就开始自己开发仪器。他的方案是减小扩增管体积以加快热传导速度。拥有多年的流式细胞术经验的他选中了跟流式细胞仪的鞘流管差不多大小的玻璃毛细管，采用高速流动的空气作为热传导介质。1989年他开发出了空气热循环毛细管PCR仪，可在15分钟内完成30个PCR循环。在用黑胶唱片机、吹风机和真空吸尘器制作了仪器原型并多次迭代后，在1990创业成立Idaho Technology, Inc.（也就是后来的Biofire），并在当年推出了Air Thermocycler，这是第一台快速PCR仪，可容纳48个样品管和4个循环程序，在20分钟内完成30个循环。凭借这款独家产品，Idaho从创业当年就开始盈利。罗氏通过会议知道了他们，找上门来拿下了他们机器的全球分销权。如上所述，在1993年，Roche（原Cetus）公司的Russ Higuchi和同事偶然发明了荧光定量PCR技术，当时采用的染料是EB（溴化乙锭），一个循环获取一次荧光信号。Carl Witwer最先将流式细胞术里的SYBR Green I引入到PCR中，替代EB。为配套SYBR Green I检测，他把流式细胞仪光学元件引入到PCR中，以实时监测PCR过程。1996年，Idaho推出荧光定量PCR仪LightCycler（这个系列的产品名称从未更改，包括Roche最新推出的dPCR就叫Digital LightCycler），第一个机型刚推出，罗氏就收购了这款产品的多种权限。Biofire公司1996年推出的LightCycler之后，在调整流式细胞仪的光学系统时候，通过连续获取荧光和温度信息，他偶然观察到DNA熔解现象。直接就将原本需要数小时，采用紫外线吸光度测量的溶解曲线分析缩短到几分钟。再后来，又一次偶然发现，使用一个探针就可以进行基因分型，他们更进一步简化了熔解曲线分析方法。但Carl Witwer觉得熔解曲线质量并不高，很难检测到微小差异。2000年，他启动高分辨率熔解曲线分析仪的开发，他想知道，如果把溶解曲线做的更精细能获得哪些额外信息。期间他们合成了30多种染料，通过新的仪器、新的软件和新的染料，最终成功开发出高分辨率熔解曲线分析方法。新开发的方法具有极高的灵敏度，甚至可以直接用染料而非标记探针准确地区分单碱基突变。- 是荧光定量PCR的技术先驱，第一个将SYBR Green I和熔解曲线引入PCR
- 发明了高分辨率熔解曲线分析，是Roche目前引以为豪的技术参数
更令人膜拜的是，他的多数学术成果，都转化成了产品，最后都被大公司收购进一步进行全球商业化了。正是在这一时期，罗氏将PCR技术引入诊断领域的努力初见成效。艾滋病是当时新发现的疾病，是许多研究人员和制药公司努力的重点。PCR 在艾滋病病原体 HIV 的检测和定量方面得到了明确的应用。罗氏公司的 Shirley Kwok、John Sninsky 及其同事开发了一种反转录定量PCR 检测方法，用于测量 HIV 病毒RNA 的拷贝数。使用已知拷贝数的共扩增对照序列和平台期前的检测有助于克服 PCR 定量中的一些障碍。该assay最终成为 Cobas Amplicor HIV-1 Monitor 检验试剂。该检测试剂盒的研制代表着将强大的 PCR 技术应用于诊断的关键时刻来临了。目前经过多次迭代已成为许多中国临床医院的检验菜单和CDC常规检测的一部分，Roche在中国市场市占率最高，是同类产品的金标准。目前最流行的两个RT-PCR两种是TaqMan探针和SYBR Green荧光染料。TaqMan 探针利用DNA 聚合酶的核酸外切酶活性，将荧光探针的末端切开与靶位点结合，释放它以便发出荧光，最适合做多重靶标检测。SYBR Green 仅与双链 DNA 结合，随着越来越多的 DNA 合成而放大其荧光信号。二者的主要区别如下：注意SYBR Green可生成熔解曲线，用于分析PCR反应的特异性，以及检测可能的基因变异，如SNP。未完待续，敬请关注下期《DNA复制的艺术 之 什么成就了巨头们的今天》。- PCR past, present and future；https://doi.org/10.2144/btn-2020-0057
- The Story of PCR；https://geneticsunzipped.com/transcripts/2020/11/3/the-story-of-pcr
- Making PCR：a story of biotechnology by Paul Rainbow
- Carroll, P; Casimir D. PCR Patent Issues. In: Inc. HP, ed. PCR Protocols. Totowa, NJ; 2003:7-14.
- P Mickey Williams, The Beginnings of Real-Time PCR, Clinical Chemistry, Volume 55, Issue 4, 1 April 2009, Pages 833–834, https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.122226
- https://blog.labtag.com/a-brief-history-of-pcr-and-its-derivatives/
|
/3 
浙公网安备33010802005999号 
