【陈巍学基因】视频3：PacBio单分子超长测序

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欢迊来到《陈巍学基因》，我们这个节目，主要是给大家介绍基因组学、临床分子诊断方面的最新技术。

本期节目，给大家介绍一下Pacific Biosciences公司的技术。Pacific Biosciences公司的简称叫PacBio。Pacbio是目前读长最长的测序技术公司。

它的读长，最长可以达到2万到3万个碱基，平均可以达到8千多个碱基。相比于llumina 和Ion Torrent的几百个碱基的读长来说，有着明显的优势。

今天，我们就给大家介绍一下这个技术。

PacBio 测序过程

PacBio的测序原理，和别的高通量测序的原理，基本上也是一样的。也是边合成，边测序。

首先，这个聚合酶是固定在测序小孔的玻璃底板上。这个聚合酶又和DNA模板、测序引物是结合在一起的。

然后加入带4色荧光的dNTP底物，这些dNTP都在其磷酸基团上被标上了荧光基团，四种碱基、各标一种颜色。

当一种与聚合酶正要合成的碱基一致的dNTP被酶抓住的时候，酶就会长时间地抓住这个dNTP,不让这个dNTP漂走。

这时侯，激发光从小孔的底部照进来，打在这个被抓住的dNTP上，就会在较长时间内发出荧光。

仪器根据所拍到的荧光的颜色，就可以来判断，这个碱基是哪种碱基。

一个循环的聚合反应发生完毕之后，焦磷酸基团就从原来的dNTP上掉下来，因为荧光基团是连到这个焦磷酸上的，所以这个荧光基团也就一起掉下来了，在溶液中就会漂走。

接下来，进行第二、第三个循环……，一直进行下去。

一张芯片上有几万个孔，同时进行测序，这样一次就可以得到几亿个碱基的序列。

接下来，分几个要点，来说明这个测序的过程。

化学方法

和Illumina一样，PacBio也采用了4色荧光基团来标记dNTP，但是PacBio的标记和Illumina的标记有所不同，PacBio的荧光基团直接是标在dNTP的3'端的磷酸基团的末端的。

这样标记的好处是：当一个聚合反应的循环完成的时侯，dNTP上的那两个磷酸基团就掉下，连在这个磷酸基团上的荧光基团也随一块儿掉下来。它掉下来之后，就在溶液中漂走，不会影响接下来的测序过程了。

测序微孔

然后，我们说一下这个测序小孔的设计。

这个测序小孔叫Zero Model Waveguide，简称ZMW。

小孔的直径很小，光只能在小孔中传输很短的距离。这个特点对PacBio的测序很重要。因为酶是被固定在玻璃底板上的，所以，只有互补的dNTP被酶抓到的时侯，这个dNTP才会较长时间地停留在离玻璃底板很近的位置。

也只有这样，才会被激发光照到，并且发出它的荧光。

PacBio的光学设计中，入射光是几百纳米波长的可见光,光从小孔的底部的玻璃处照到小孔中来。这个，只有70纳米。

其它游离的dNTP，只会非常短暂地进入小孔，又很快漂走。所以，这些游离dNTP带来的的噪音（信号），就被抑制在很低的水平。

哑铃状的文库

接下来，我们说一下PacBio的建库。

PacBio的建库是比较特别的。它的库是在DNA片段的两段各接一下发夹型的接头。接好了发夹形的接头之后，形成的文库是一个哑铃形的文库。

这种哑铃形状的文库有个好处，那它整个分子实际上是一个圆环。在测序的过程中它可以周而复始地进行测序，这对于发挥PacBio的长读长的优势是很有益处的。

超长读长的根本原因 -- 单分子测序

接下来，我们说一下PacBio它测序长度优势的来源。这个来源，是因为它测的是个单个分子。

相比之下，Illumina或者Ion Torrent测的都是一簇分子。或者说它们测的都是一大堆分子。当它测一大堆分子的时侯，每个循环，多多少少，总有一些分子落后；也多多少少，有些分子超前。

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