IVD前沿丨人工尿液生物标志物探针（AUBP）的前景

图片来源：Nature reviews bioengineering

在现代临床实践中，尿检被认为是最常见、最简单、最微创的筛查检查。尽管在代谢性和泌尿系统疾病方面取得了显著的成就，但由于尿液中内源性生物标志物的浓度低、疾病特异性差，尿液分析在诊断方面存在局限性。为了便于尿液分析，人工尿液生物标志物探针（AUBPs）的新型诊断药物已经被开发出来。AUBP是一种小分子或纳米大小的成像探针，旨在通过在体内与疾病相关的内源性生物标志物相互作用，释放人工尿液生物标志物（AUBs）（图c）。到目前为止，AUBP已在各种动物模型中被验证用于诊断、预后和治疗应用，具有良好的临床转化前景。

基于AUBP的疾病诊断尿液检测。   

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AUBP可大致分为两类：intrinsic AUBP和AUB分泌纳米探针（下图）。intrinsic AUBP是单分子探针或超小纳米探针，可以通过肾脏过滤或分泌到尿液中，本质上是作为AUB。AUB分泌纳米探针不能被过滤或分泌到尿液；它们对疾病相关的内源性生物标志物作出反应，分泌小片段信号分子。尿液中的AUB可以通过各种技术，利用其光学、质量、生物和催化特性进行检测。AUB还可以进行DNA编码，DNA条形码可以与CRIPSR-Cas系统相结合再次进行信号放大。

AUBP的分类。图片来源：Nature reviews bioengineering

急性肾损伤（AKI）。开发了一系列可激活的小分子AUBP（称为MRP1-MRP3），用于响应肾损伤的生物标志物，如超氧阴离子、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶和caspase-3（图a)。基于MRP1的尿液分析可以比临床内源性生物标志物，包括KIM-1，至少早12小时将AKI与健康肾脏区分开来，显示了其在早期诊断AKI方面的临床潜力（图c）。

缺血-再灌注损伤（IRI）。 ROS引起的氧化应激是IRI损伤的一个标志，APNSO纳米探针是一种响应超氧阴离子的可激活荧光团，可以通过体内成像和尿液分析分别检测到再灌注后15 min和1小时的肝脏IRI（图f）。

AUBP在AKI和IRI中的应用。

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血栓形成。凝血酶是凝血级联反应中最重要的丝氨酸蛋白酶，可被凝血酶反应性纳米蠕虫检测到（图g）。这些AUBP具有可被凝血酶裂解的底物-报告串联肽，可通过ELISA或单分子ELISA检测。肺血栓小鼠静脉注射后可实现基于ELISA-based的比色分析（图h）。

炎症性肠病（IBD）。口服给药的基于铂纳米点的纳米聚集体可响应炎症性肠病小鼠模型炎症肠段的ROS，进行解离并释放超小的铂纳米点，在尿液中富集后，可通过催化特性进行检测（图k）。该平台可以比粪便钙卫蛋白（IBD临床生物标志物）提早3天识别健康小鼠和IBD小鼠。

AUBP在血栓形成和IBD中的应用。

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肿瘤细胞分泌蛋白酶以及糖苷酶，以促进活跃的葡萄糖代谢和能量供应。这些酶可作为AUBP评估肿瘤负担的发展中流行的癌症生物标志物。例如，静脉注射名为CyP1的荧光探针，可进入尿液到达小鼠膀胱，与膀胱癌生物标志物氨肽酶N（APN）反应，释放其荧光片段，信号与肿瘤的大小相关。

多重检测肿瘤蛋白酶可提高特异性；例如，一种AUBP包含多种蛋白酶底物（图h），与癌症相关蛋白酶反应，会释放裂解片段作为AUB，且AUC随着蛋白酶类型的增加而增加。这种多重AUBP可以区分由Kras或Trp53突变或Eml4-Alk融合驱动的癌症，并可识别出超小肿瘤，优于临床生物标志物（图i）。

AUBP在癌症中的应用。

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移植排斥反应是由大量过度反应的T细胞引起的。“T型细胞”是排斥反应的主要介质，其标志物为颗粒酶B。颗粒酶B的可激活多荧光团纳米传感器（APNG）可在小鼠移植肝脏中积累，其中高水平的T细胞和颗粒酶B解聚APNG，释放AUB。该探针最早可以在移植后3天报告排斥反应（图b，c）。此外，APNG还可以测量免疫相关蛋白酶，从而可以长期监测免疫治疗的疗效（图d）。除此之外，颗粒酶B还可以作为筛选免疫治疗药物及其最佳剂量的指标。

AUBP在移植排斥反应中的应用。

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病毒的检测可以通过使用对特异性的蛋白酶敏感的AUBP来实现。例如，尿液分析SARS-CoC-2感染的AUBP（SARS-CyCD）是通过靶向Mpro开发的，病毒存在的情况下，Mpro可裂解探针释放出荧光片段用于尿液分析。

AUBP可以大大扩大尿液分析中可检测的生物标志物和疾病的范围。通过与特定的疾病生物标志物相互作用，AUBP将无法获取的体内疾病相关信息转化为AUB用于体外检测，更易进行信号放大，并允许经济有效的随访监测。

尽管如此，基于AUBP的尿液分析也有局限性，最重要的是在设计特异性和复杂性之间的权衡。复杂设计不适合扩大规模的工业生产，还增加了引入毒素的风险。AUBP在体内的药代动力学也要进行考量；长循环（数小时至数天）可能增加主要器官的积累相关毒性，而短循环（数分钟至几小时）则降低在病变中积累甚至错过某些疾病的机会。

错误的给药途径也可能增加漏诊的机会；例如，静脉注射AUBP可能无法在肠腔内积累在结肠癌。无创或微创的给药途径，如口腔、鼻、气管内、皮肤和皮下应用，涉及生理屏障，可能损害具有化学脆弱成分的AUBP。

AUBP的设计还应考虑它们的位置和如何应用。例如，用于医院使用的AUBP可以设计为静脉注射剂，允许可获得各种组织和器官进行快速检测。对于家庭测试，应以更容易的给药途径，如口服、吸入、经皮给药和皮下注射（如胰岛素注射）。至关重要的是要确保易于处理尿液样本（最好是未经处理的尿液）和对结果的直接解释。

材料科学、医学和计算机科学方法的结合可以进一步提高AUBP的检测特异性和灵敏度。生物信息学结合下一代测序、组学技术，可以帮助选择与疾病相关的内源性生物标志物，以指导AUBP的分子设计。研究结果还可以与当地的医疗保健提供者分享，并在需要时提供及时的治疗。最后，AUBP是一种新型的显像药，涉及体内给药和体外诊断，其安全性和有效性的标准尚未建立。未来的临床前研究和临床试验将有助于指导新研究的设计和制定监管政策。