余方友教授：临床耐药菌研究前沿

近年来，碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌因具备耐药谱广和致死率高两大特点，给我国乃至全世界的抗感染治疗带来严峻的挑战。

日前，同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授团队的一项研究通过遴选和表征KL1、KL2和ST11-KL64型三种典型碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌的分子特点和差异，探索了促使优势克隆群流行传播的相关因素。该研究发表在Drug
Resistance Updates（IF:24.3）。

该研究从11家三级教学医院中分离出109株碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌，依据进化分析从中遴选出KL1型CR-hvKP、KL2型CR-hvKP及ST11-KL64hv-CRKP三株典型的碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌进行后续研究。

研究发现，与ST11-KL64hv-CRKP相比，KL1、KL2高毒力谱系的耐药性决定因素明显较少，对抗生素的耐药性水平较低。尽管在所有这些分离株中都能检测到blaKPC基因，但KL1/KL2-hvKP菌株没有表现出相应的高水平碳青霉烯类耐药性。与抗性特征不同，该研究并没有观察到三种菌株之间显著的毒力差异。研究中的ST11-KL64
hv CRKP与KL1和KL2
hvKP相比，表现出相似的粘膜粘度、铁载体和生物膜产生。ST11-KL64-hvKP的高通气性也在人肺上皮细胞感染和梅洛内氏菌感染模型中得到了验证。

此外，该研究发现pLVPK样毒力质粒和IncF-bla_KPC-2质粒对形成高毒力和耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌至关重要。在这些毒力质粒和bla_KPC-2质粒中，转移位点起源（oriT）的保守性表明，毒力质粒可以在bla_KPC-2质粒的帮助下转移到CRKP。毒力质粒和bla_KPC-2质粒的共存促进了ST11-KL64hv-CPKP的形成，从而在抗生素作用下行成院内感染。

总之，该研究发现ST11-KL64
hv-CPKP具有耐药谱广和致病性高的特点，是未来急需关注的高危克隆群。

结核病是一种由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，对全球公共卫生持续构成重大威胁。随着结核分枝杆菌耐药菌株的出现，也对我们的检测工具提出了新要求。但目前而言，不同诊断试剂盒在诊断效率、抗结核药物覆盖范围和相应的耐药基因位点方面存在一定差异。

日前，同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授团队的一项研究表明，靶向NGS测序技术（tNGS）在结核病鉴定及一线耐药检出方面表现出巨大潜力。该研究发表在Journal
of Infection（IF：28.2）。

该研究纳入疑似肺结核患者130例，使用tNGS对参与者支气管肺泡灌洗液的cfDNA进行结核分枝杆菌检测以及一线耐药检测。发现tNGS对结核分枝杆菌的检出率为63.1%，明显高于抗酸杆菌涂片镜检、培养和免疫学检查的检出率。与快速自动化的实时核酸扩增检测方法（Xpert
MTB/RIF）相比，tNGS表现出几乎相同的灵敏度，特异度、临床符合率差异均无统计学意义。

随后，通过一线抗结核药物耐药检测，Xpert检出4例利福平耐药，对比药敏试验，发现存在1例假阳。该假阳案例经tNGS和药敏试验检出均为异烟肼耐药。以药敏试验为参照标准，tNGS检测利福平耐药性的敏感度和特异度均为100%，检测异烟肼耐药性的灵敏度和特异度分别为80%和100%。

总之，该研究表明tNGS检测方法对结核病诊断具有一定的指导意义，其检出效能或与Xpert
MTB/RIF相当，表明tNGS技术或可成为结核病诊断中一项有潜能的新技术。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种对许多抗生素具有抗药性的细菌，能够引发严重的感染。近年来，一种名为ST764的MRSA克隆型在中国和亚洲其他地区快速传播，备受关注。然而，我国对MRSA
ST764的遗传特征和毒力特征的了解仍然有限。

日前，同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授团队的一项研究探所了我国新出现的高毒力MRSA
ST764-t1084克隆型的遗传特征和毒力特征，为制定感染预防和控制措施提供参考。该研究发表在Emerging
Microbes & Infections（IF:13.2）。

在该项研究中，研究人员鉴定了2014年至2021年间从我国五个城市收集的52个ST764
SCCmec
II型分离株。全基因组测序显示，我国ST764最常见的葡萄球菌蛋白A（spa）类型为t002（55.78%）和t1084（40.38%）。毒力测定表明，ST764-t1084菌株具有较高的溶血活性和α-毒素水平。在影响α-毒素产生的关键调控因子中，只有SaeRS在ST764-t1084分离株中高表达。

小鼠脓肿模型表明，ST764-t1084分离株的毒力与以高通气性著称的金黄色葡萄球菌USA300-LAC的毒力相当。有趣的是，ST764-t002分离株比ST764-t1084分离株表现出更强的生物膜形成和细胞粘附能力。这也可以解释为什么ST764-t002亚克隆近年来在中国越来越普遍。

系统发育分析表明，中国ST764分离株与日本KUN1163分离株亲缘关系密切。值得注意的是，基因组分析显示，52个ST764分离株不携带精氨酸分解代谢移动元件，这与日本的ST764隔离株不同。此外，与KUN1163相比，大多数ST764分离株（69.23%）在SCCmec
II盒区具有约5kb的明显缺失。

总之，该研究揭示了MRSA
ST764-t1084克隆型的遗传特征和毒力特征，可为制定感染预防和控制措施提供参考。

世界卫生组织已经确定了新的结核病诊断的优先目标产品，其中包括基于快速生物标志物的非痰液诊断测试，使用易于获取的样本。结核分枝杆菌宿主反应检测试剂（MTB-HR）能够检测人全血、指尖血结核特异性宿主应答反应，通过评估3个特征基因（GBP5、DUSP3、KLF2）的表达水平来辅助诊断结核病。

日前，同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授、结核科沙巍教授团队探究了MTB-HR多结核病筛查和分类试验的潜力，并表明其具有更高的诊断收益。该研究发表在Emerging
Microbes & Infections（IF:13.2）。

该研究纳入了192例活动性结核病患者、137例结核分枝杆菌潜伏感染者、224例其他肺部疾病患者以及100名健康志愿者。发现MTB-HR在区分未经治疗的活动性结核病与非活动性结核病、结核分枝杆菌潜伏感染、其他肺部疾病和健康志愿者方面的相应AUC值分别为0.814（95%CI：0.760-0.868；敏感度为76.1%，特异度为71.6%）、0.739（95%CI：0.667～0.812；敏感度为59.7%，特异度为78.1%）、0.825（95%CI：0.770～0.880；敏感度为82.1%，特异度为65.6%）、0.892（95%CI：0.839～0.945；敏感度为76.1%，特异度为88.0%）。当只纳入TAT小于1小时的标本时，MTB-HR在区分未经治疗的活动性结核病与非活动性结核病的AUC最大，为0.920（95%CI，0.822-1.000，灵敏度81.3%，特异性87.7%）。

该研究表明，MTB-HR检测表现出一种快速活动性结核病筛查和分类的潜力，特别是对于未经治疗的活动性结核病，由于血液更容易获得，因此具有更高的诊断收益。

多重耐药肺炎克雷伯菌因耐药谱广、致死率高及传播速度快而闻名。质粒介导的获得性耐药，是促进其形成的重要因素。CRISPR-Cas系统具备特异靶向耐药基因或质粒的特点，作为防控耐药菌形成的潜在策略备受关注。

日前，同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授、复旦大学附属华山医院检验科蒋晓飞教授、Hackensack
Meridian医学院Liang
Chen教授团队的一项研究探索了肺炎克雷伯菌所携带的天然CRISPR-Cas3系统在消除IncFII型多重耐药流行质粒的应用，为利用内源性CRISPR-Cas3系统解决肺炎克雷伯菌多重耐药问题提供有力支持。该研究发表在EBioMedicine（IF:11.1）。

该研究检测了来自肺炎克雷伯菌基因组的725个完全测序的IncFII质粒中的匹配原间隔区。然后，重新设计了一个天然的CRISPR-Cas3系统，并通过偶联提供CRISPR-Cas3系统。应用质粒杀伤效率和G.mellonella感染模型评估CRISPR-Cas3的体内外免疫。

基因组分析显示，大多数IncFII质粒可以被具有多个匹配原间隔区的天然CRISPR-Cas3系统靶向作用，并且靶向区域在不同的IncFII载体中高度保守。这种偶联的内源性CRISPR-Cas3系统在意大利黑加仑菌感染模型中的体外和体内表现出较高的质粒治愈效率，并在系统进入易感细菌宿主后提供了对IncFII质粒入侵的免疫。

总体而言，该研究证明使用天然CRISPR介导的质粒治疗使耐药肺炎克雷伯菌对多种抗生素重新敏感的适用性。这项工作为利用天然CRISPR-Cas系统解决肺炎克雷伯菌AMR的想法提供了有力的支持。

表皮葡萄球菌是一种常见于人类皮肤和粘膜上的典型无害细菌，由于几十年来医用植入物的使用增加，它已成为医院感染的主要病原体。表皮葡萄球菌主要通过形成生物膜，逃避宿主免疫反应并抵抗抗菌剂的渗透，很少有药物能在生物膜形成后将其根除，这也通常会导至持续性和复发性感染。

日前，同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授团队的一项研究表明，莫匹罗星可通过上调自溶素AltE的表达来增强表皮葡萄球菌生物膜的形成。该研究发表在International
Journal of Antimicrobial Agents（IF：10.8）。

莫匹罗星是一种广泛用于葡萄球菌去定植和抗感染的抗菌剂，强烈刺激表皮葡萄球菌的生物膜形成。尽管多糖细胞间粘附素（PIA）的产生不受影响，但莫匹罗星通过加速自溶显著促进细胞外DNA（eDNA）的释放，从而在生物膜发育过程中积极触发细胞表面附着和细胞间聚集。

从机制上看，莫匹罗星可调节编码自溶素AtlE以及程序性细胞死亡系统CidA-LrgAB的基因的表达。通过基因敲除，研究人员发现AtlE的缺失，消除了对莫匹罗星治疗的生物膜形成和eDNA释放，表明这种作用需要AtlE。在Triton
X-100诱导的自溶测定中，发现与野生型菌株和互补菌株相比，莫匹罗星处理的AtlE突变体显示出较慢的自溶速率。

因此，研究人员得出结论，低抑制浓度的莫匹罗星以AtlE依赖的方式增强表皮葡萄球菌的生物膜形成。因此在临床使用莫匹罗星抗感染过程中的谨慎应用，避免抗生素浓度过低引起的不利影响。

MRSA在中国的主要流行克隆型有ST5、ST59和ST239。然而有研究表明，近年来ST22克隆已在中国出现，并在某些地区显示出取代ST59克隆型的趋势，但这些研究主要基于流行病学调查，没有深入分析毒力特征和基因组特征。

日前，同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授团队对我国MRSA的ST22克隆型进行了基因组和表型鉴定，证明了其独特的分子流行病学。该研究发表在mSystems（IF：6.4）。

该研究收集了来自我国各省市的30株ST22菌株，对这些菌株进行了基因组和表型鉴定，并重建了ST22菌株在我国的分子进化过程。通过对来自中国的30株ST22菌株和来自全球的480株ST22毒株的系统发育重建，该研究发现全球ST22菌株可分为三个分支。

我国ST22菌株主要在分支II（IIb和IIc）和分支III中发现，表明中国ST22-MRSA克隆具有不同的起源。我国亚型IIb毒株（SCCmec
Vb-t309）可能是从天然的ST22
MSSA克隆进化而来，而IIc毒株可能是从其他国家传播而来。与USA300和其他占主导地位的HA-MRSA（ST5和ST239）或CA-MRSA（ST59）菌株相比，IIc亚类（SCCmecIVa-t309）菌株在意大利黑加仑菌感染和小鼠皮肤脓肿模型中表现出特别强的致死性和侵袭性。在体外和体内表现出显著更高的毒力。

研究指出，该亚类毒株的进一步传播可能对我国和其他地区的卫生系统构成严重威胁。

ST45型高毒力MRSA克隆型是国际上流行MRSA的主要代表之一，在血液中表现出较高的存活率，因此与菌血症和患者死亡率增加密切相关。然而，目前仍缺乏ST45克隆型相关遗传和表型分析研究，且我国分离的ST45型MRSA菌株的毒力依然未知。

日前，同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授、Hackensack
Meridian医学院Liang
Chen教授团队分析了我国分离的ST45菌株的遗传和分子特征，探索了其引发血流感染的毒力潜能，揭示了该克隆型MRSA菌株的高毒力，为临床感染和预防提供了新见解。该研究发表在mSystems（IF：6.4）。

该研究收集了2014到2020年间我国7个省市分离到的共565株MRSA，并进行了全基因组测序，其中ST45克隆型MRSA共有27株。流行病学结果表明，MRSA
ST45分离株多来源于血液，携带多种毒力和耐药性基因，以葡萄球菌盒式染色体mec
IV型（SCCmec
IV）为主。

为了探究我国分离的ST45克隆型MRSA的毒力，研究人员进行了溶血素活性检测和全血杀伤实验，并构建了蜡螟感染模型和小鼠菌血症模型。结果表明ST45-SCCmec
IV-t116分离株（MR370）的毒力高于其他菌株，具有较强的溶血素活性和全血中生存的能力，以及感染蜡螟幼虫和小鼠的高致病性。ST45-SCCmec
V-t1081分离株（MR387）的溶血素活性较低，但显著高于ST5型MRSA分离株。在人全血中、蜡螟和小鼠体内，ST45-SCCmec
V-t1081株的毒力与USA300高毒菌株相当。因此，两株ST45型MRSA分离株均具有引起血流感染的高毒力潜能。

荧光定量PCR的结果显示，ST45型MRSA中免疫逃避基因scn、chp、sak和调控因子saeR、agrA、RNAⅢ的表达均高于USA300，进一步表明了菌株的高毒潜力，其中SCCmec
IV-t116株的表达量显著高于SCCmec
V-t1081株。

总之，该研究揭示了ST45型MRSA菌株引发血流感染的高毒力潜能，为临床治疗和预防提供了新的见解，并通过RT-qPCR推测其与免疫逃避基因的高水平表达有关。

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）已成为临床管理和全球公共卫生面临的主要挑战之一，氨基糖苷类药物是治疗CRKP引起的感染的重要选择，通常与β-内酰胺类药物和替加环素联合用药。然而，近年来有报道称，CRKP的氨基糖苷类耐药性增加，这对治疗提出了新的挑战。

日前，同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授、温州医科大学附属第一医院王良兴教授团队鉴定了一种ST15-KL112
CRKP FK3006，它不仅对碳青霉烯类药物表现出耐药性，而且对氨基糖苷类药物也表现出高水平的耐药性。该研究发表在Frontiers
in Microbiology（IF:5.2）。

研究表明，FK3006除了具有多药耐药表型外，还具有典型的致病特征，包括高黏滞和高通气表型。根据全基因组测序，在FK3006中观察到一个pLVPK样毒力质粒和三个关键抗性质粒（bla_OXA-232、bla_CTX-M-15和rmtF）。与其他典型的ST15-CRKP相比，pLVPK样毒力质粒（p3006-2）的存在赋予FK3006高毒力特征。在FK3006中观察到高铁载体产量、更多的细胞侵袭性和对血清杀伤的更强抵抗力。通过蜡螟感染模型也进一步证实了FK3006在体内的高毒力表型。

此外，根据结合试验，p3006-2毒力质粒也可以在结合IncFIIKp3006-11质粒（bla_CTX-M-15）的帮助下诱导转移。除了可传播的质粒外，在bla_CTX-M-15和rmtF周围还发现了几个插入序列和转座子，以产生可移动的抗微生物耐药性岛（ARI），这也对耐药性决定簇的传播做出了重大贡献。

该研究指出，发现抗性和毒力质粒的共存不仅产生了高风险的高毒力多重耐药表型，而且增加了非偶联毒力质粒的传播威胁。未来，当质粒分析成为高危细菌的常规检测方法时，或可实现尽早进行必要的干预，降低患者死亡率。

耐多药（MDR）革兰氏阴性菌的日益流行和有限的抗生素选择，对全球公共卫生构成了重大威胁。多粘菌素B是对抗广泛耐药革兰氏阴性菌感染的最后手段。然而，大量革兰氏阴性菌已对多粘菌素B表现出高度耐药性，为治疗带来极大困难。

日前，同济大学附属上海市肺科医院检验科余方友教授团队的一项研究发现，夫西地酸与多粘菌素B联合使用，可解决多耐药炎克雷伯菌和大肠杆菌对多粘菌蛋白B的耐药性问题。该研究发表在Frontiers
in Microbiology（IF:5.2）。

该研究选择了包括肺炎克雷伯菌和大肠杆菌在内的革兰氏阴性菌株，以探讨夫西地酸和多粘菌素B是否具有协同杀伤作用。通过肉汤微量稀释，观察到添加夫西地酸后显著降低了测试分离株中对多粘菌素B的最低抑制浓度（MIC）。且棋盘格分析表明多粘菌素B和夫西地酸之间具有协同作用。此外，时间杀伤实验表明，多粘菌素B和夫西地酸的联合用药在杀死细菌方面比单一药物更有效。

最后，通过小鼠模型研究表明，与单药治疗组相比，联合治疗组的存活率更高，也为多粘菌素B和夫西地酸之间的协同作用提供了证据。夫西地酸可提高耐多药大肠杆菌和肺炎克雷伯菌对多粘菌素B的敏感性，从而增强其杀菌活性。

研究为克服多粘菌素B耐药性的潜在策略提供了新的见解，但仍需要进一步研究来评估其在实际临床环境中的可行性。