百万分之一的Q60!？Ultima Genomics: 我们还有通往10美元基因组的路线图 ...

Ultima 采用的是电子行业常用的200 毫米晶圆，这是从全球半导体行业丰富的供应链中提取的简单硅盘。DNA克隆珠子结合在表面。测序流和清洗缓冲液被悬加到圆盘的中心，并通过借鉴半导体制造的非接触式旋涂技术通过离心力进行分布，这也是计算机芯片制造工艺的另一个支柱。每种试剂均通过单独的喷嘴输送，消除了流动之间的污染。旋涂试剂以均匀的薄层形式展开，最大限度地减少试剂消耗，并避免流通池中可能出现的入口处和拐角处的混乱流动问题。

通过自动乳液 PCR 制备克隆 DNA。乳液 PCR 和经常令人讨厌的破乳操作由机器执行，产生一管珠子，可加载到仪器上。

测序图案的成像在晶圆旋转时连续进行，无需快速加速和停止，相机即可对传统流通池的多个区域进行成像。每台 UG100 仪器可以同时运行两个晶圆，晶圆在化学站和成像站之间交替。使用当前的化学物质，每个测序运行时间少于 14 小时，仪器每天可以运行 4 个晶圆。UG100内置 24/7 自动化，可最大限度地提高通量并最大限度地减少操作员接触点。其可装载多达 6 组晶圆以及足够的测序试剂，可供 60 小时不间断运行。

二、产品性能

UG100每次运行每个晶圆可产生 60-80 亿次单端读取。由于它是流式化学，因此读取长度是一个分布，预计中位数为 300 个碱基，但对于不需要这么大读长的应用，运行速度可以更快，以节省测序试剂并增加仪器占用率和通量。Ultima称，每块晶圆售价 2,000 美元，即每百万次读取大约0.30美元。

通过利用大多数天然核苷酸的流式化学，UG 100显着降低了试剂成本，添加一次聚合酶就足以完成整个测序运行，与传统系统相比，所需聚合酶的量减少了 300 倍，并且大大减少了昂贵的荧光标记核苷酸的使用。试剂和测序底物成本的降低相结合，提供了领先的测序经济效益。

这样，一台UG10012 小时运行产生6Tb数据，每年可生成 2万个人的30x基因组，每个基因组100美元。Ultima 已成功在一台仪器上每周运行 22 个晶圆，读取长度为 300bp，每周运行 28 个晶圆，读取长度约为 225bp。

从这样的运行性能来看，UG100成为超高通量测序领域真正的参赛选手。

在这场短读长 NGS 竞赛中，现实的竞争对手是：Illumina NovaSeqX 25B（一年两万个人基因组，200 美元/基因组；升级前的NovaSeq 6000 S4一年能测序13,000个人基因组），以及MGI DNBSEQ T20x2（一年五万个人的基因组，100 美元/基因组）。

将 Ultima 晶圆与 Illumina 的 NovaSeq X 流动池的价格进行比较，每个晶圆的成本低于最小的 X 流动池1.5B，同时提供比最大的 X 流动池25B更低的每 Gb 成本。

通过大多数天然核苷酸的基于流的化学，UG 100可以产生更有利的误差曲线以允许高精度单核苷酸变体 (SNV) 检测。对于传统的终止化学，在单核苷酸延伸过程中错误添加额外的碱基，或者未能添加正确的碱基，会导至定相错误，该错误会随着读长的函数而累积。此外，由于所有碱基都是一次性添加的，因此碱基调用的挑战在于确定添加了哪种碱基类型，从而导至碱基替换成为主要错误模式。相比之下，基于流动的化学的任务是确定添加碱基的正确数量，而不是确定添加碱基的身份。这导至固有的碱基替换的低错误率。

然而，这种方式的挑战是均聚物长度必须根据检测信号的强度来确定，本质上很难区分到底是添加了12个还是13个同样的碱基。与传统的基于流的系统不同，UG 100具有测量稳态而不是瞬态信号的优点，并且能够利用现代机器学习技术在所有可用的碱基背景中微调碱基调用算法。这导至均聚物准确度显着提高，UG 100的信号在均聚物长度达12 个碱基的情况下呈线性，即使对于长度为 12 的均聚物，F1变异识别准确度也保持在 95% 以上（8 聚体和 9 聚体的准确度为 99%，而 12 聚体的准确度约为 96%），这可与终止化学相媲美。

UG 100 系统在INDEL和 SNV 的精确度、召回率和 F1 分数方面产生非常高的值，证明了系统的高精度。例如，SNV F1 准确率超过 99.8%，Indel F1 准确率平均为 99.4%（首次退出隐身模式时为 96% ）。

凭借这种高通量测序的高精度和经济性，新的应用（无论是多组学、单细胞、罕见 DNA 突变检测还是常规疾病相关监测）不再受到高成本的限制。

三、ppmSeq及Q60

由于SNV代表了绝大多数胚系和体细胞变体，因此专门衡量测序平台调用的SNV的质量是有用的。这对于罕见事件检测应用尤为重要，例如测序cfDNA以检测是否可以检测到任何残留肿瘤。在这种情况下，关键问题是所谓的SNV是真正代表ctDNA，还是实际上是带有碱基调用错误的正常DNA。Ultima这里选用了一个名为SNVQ的度量来量化：表示特定替换调用是错误的概率。例如，如果误差概率为10⁶（即百万分之一），SNVQ值将为Q60。典型UG 100测序运行的SNVQ分布——>85%的替换的错误概率小于1万分之一。

UG 100平台的高SNV精度是其高度精确的基于流动化学的结果，这使得它不太可能将一个碱基误认为另一个碱基。此外，在UG 100标准测序模式下观察到的碱基替换实际上不是由于测序仪的错误，而是来自通常观察到的样本错误。

在SNV的罕见低频检测上，Ultima此次推出了新的ppmSeq™ 技术-配对加减测序。对于最苛刻的应用，如检测最小残留疾病（MRD），在文库制备期间进行简单的接头更改可以实现Ultima Genomics的ppmSeq技术。这项技术可以很容易地区分从样本错误中得出的真变异和假阳性，并在碱基调用步骤中过滤掉这些样本错误衍生的假阳性。这最终产生了干净、高质量的读数，具有百万分之一的SNP错误率。>80%的SNV调用的错误为百万分之一或更低。所有这些都来自原始数据，没有过度测序，无需分子条形码、UMI或读取的叠加。

ppmSeq是Ultima提供的标准测序运行，但文库制备试剂盒和分析略有不同。ppmSeq与现有的双链测序方法类似，不同之处在于它将两条 DNA 链捕获到同一个乳液 PCR 珠上。当对DNA双链变性时，需要它们放在乳液中，在 ppmSeq中，文库分子的两条链都附着在珠子上并进行扩增；而在许多其他操作中，仅结合一条链。这导至每条链都产生扩增产物。在 ppmSeq中，文库分子的两条链都附着在珠子上并进行扩增；而在许多其他操作中，仅结合一条链。这导至每条链都产生扩增产物。

使用其他双链测序方法时，互补分子需要捕获在一起，导至文库中只有 3% 到 4% 产生双链数据。但ppmSeq在测序的双链 DNA 上添加了条形码，因此两条链可以一起分析。本质上，不需要让两条链找到彼此。这样，可以从100x基因组中获得 50x的双链覆盖率，而不是3x覆盖率，因此也降低了基因组水平双链测序的成本。

由于 Ultima 使用流动化学，任何碱基混合的位置（由于早期 emPCR 带入的错误或更常见的是如果一条链上的碱基受损）都会导至信号的彻底相移。相比之下，采用 4 碱基合成测序时，一个碱基只会出现微小的信号变化，难以检测。然后下游软件可将读取的内容剪裁锁定在损坏的位置。这个过程中，并没有尝试纠正实际的测序错误，因为 Ultima 基于流的化学不太会产生替换错误，因此一旦消除了样本错误，百万分之一或更好的准确度是可能实现的。

Ultima 的ppmSeq技术引入了 SNVQ 60 的全新时代，即碱基替换的百万分之一原始错误率。通过识别测序仪上游引入的样本错误，ppmSeq实现了测序仪精度近乎完美水平的巨大飞跃。

纽约基因组中心的 Dan-Avi Landau 演示了使用 ppmSeq 检测cfDNA 中的癌症驱动突变。Ultima 的 ppmSeq技术可以为各种需要极高 SNV 准确性的体细胞应用带来变革，例如游离 DNA 和液体活检等大海捞针式的应用。

四、应用讨论

总体上来看，UG 100是一款超高通量系统，专为大批量应用而构建，其适用于需要更高测序深度、广度或高频的应用，这其中MRD 检测和全基因组测序都是首当其冲的用例。在 SNV 检测方面的独特优势，加上以更低的成本，Ultima可以实现更大的测序深度。因此，大型诊断厂商都热衷于跟Ultima建立联系。

之前，再生元制药RGC、Exact Sciences（再生元和Exact也同时作为股东投资了Ultima）、Quest Diagnostics都宣布与Ultima建立了合作并通过早期访问进行了技术的验证。RGC称要使用UG100进行更多的人群队列测序，Exact称要利用 Ultima 的测序技术开发一项或多项癌症诊断测试，Quest称合作开发基于测序的临床检测，包括MRD及儿科罕见疾病检测的全基因组测序等。

通过早期访问计划与几个大客户合作，Ultima不光进一步成熟了其技术，并且证明其在大型应用中的优势。这些大型客户包括Broad研究所、RGC、Exact Sciences、纽约基因组中心、Macrogen、威尔康奈尔医学院等。之前的消息称，Ultima已经在十多个早期试用客户那里安装了UG 100系统。除了抢先体验期间进行的产品改进外，Ultima 还与行业内的多家供应商建立了合作伙伴关系，以改进工作流程并为上游文库制备试剂提供多种来源，并简化专为 Ultima 技术设计的下游分析。这其中包括IDT专为其设计的xGen NGS 产品、Sentieon和Google Health为其优化的二级分析算法、并与NVIDIA合作将其GPU嵌入到测序仪中，等等。

Ultima称100美元基因组仅仅是开始，正在努力开发第二个平台，以提供更低的成本和更大的规模。Ultima 表示，他们有一个 10 美元基因组甚至更低成本的路线图。最直接的是，UG100目前使用的200mm晶圆并不是半导体行业中最大的；增加至 300mm 晶圆将使可用面积增加约两倍以上，这可能会直接将基因组测序降到100美元以下。

但问题是，花费150 万美元购买仪器，实现100 美元的基因组，真的会改变游戏规则吗？

最终，一些基因检测应用会受益于测序成本的下降，可能会有推动更多内容的测序，如WES、WGS、GCP等，甚至一些转录组学、蛋白组学的方法也会受益于更便宜的DNA测序。

虽吃但到，超高通量测序领域新玩家Ultima入局，期待给行业带来不一样的推动和贡献。