从Sanger测序到新一代测序（NGS）背后的努力

使用边合成边测序技术(SBS)，新一代测序(NGS)第一个完全测序的大基因组是噬菌体。有了NGS，一个人类基因组的测序现在可以在2天内以200美元的价格完成。NGS中的SBS是由“可逆末端终止”作为核心技术。Sanger测序是基于从DNA模板中合成截断的DNA片段。这些截断是由于标记双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)的随机掺入导至伸长链过早终止。这是“终止化学”的最早形式，其中截断的合成DNA链通过凝胶电泳进行大小分离，然后重建原始DNA序列(下图)。电泳测序和类似的基于大小的核酸片段分离既耗时又费力。

要使NGS这种测序方法成功，需要解决几个挑战。包括在脱氧核糖的3'-OH上确定一个适当的保护基团，使核苷酸一次一个地结合，在四个核苷酸上分别连上荧光团，同时使其不会破坏核酸合成；设计一种能容忍这些修饰的聚合酶，使荧光检测和切割终止基团成为可能；发展适当的表面化学以结合DNA链，并最终发明一种系统来规避低荧光信噪比并纠正由于聚合酶错误结合dNTP而导至的潜在错误。

早期的工作重点是在dNTP的3'-OH上设计荧光团，作为终止化学的保护基团，但最终证明不可行。另外，研究发现在核碱基上连接一个大的荧光团偶然地通过位阻起了终止剂的作用，从而避免了保护3'-OH的需要。但这种方法增加了测序过程的步骤数，而且很容易将dNTP误掺入。这意味着可逆终止化学和荧光检测必须相互分离。

解决这一限制的可行策略需要一个结构简约的3'-OH保护基团，使dNTPs保持作为DNA聚合酶的活性底物的能力，可快速切割，并同时保持DNA完整性。基于叠氮的保护基团，一种非天然产物，可被用来盖住3'-OH，其可通过Staudinger反应(Staudinger reaction)去除。使用不同标记的荧光dNTPs，在碱基本身携带荧光团，可实现dNTPs的精确碱基结合(下图)。这一发现是开发NGS的第一步。可逆终止化学和四色荧光检测读出的发明使SBS无需进行电泳，因此更快，更准确。

一种基于固体表面的NGS技术需要四个“可逆终止”dNTPs，这些dNTPs被设计成每种核碱基具有不同光谱的可切割荧光团。先前的研究表明，对于“不可逆终止”化学，报告蛋白可以直接连接到核碱基而不影响沃森克里克-富兰克林碱基配对，只要它伸出核碱基的外缘，即Hoogsteen面。

聚合酶延伸率是潜在的限制，因为它受到大荧光团的影响以及非天然dNTPs的错误掺入。第二个主要的化学挑战是开发四种不同的可用于固体表面的荧光基团。Solexa团队成功地设计了四个dNTP，每个都显示一个独特的荧光团，由可切割的linker连接，可以在每一轮dNTP结合后移除。特别是荧光鸟嘌呤核碱基很难开发，因为鸟嘌呤由于其低氧化还原电位引起的单电子转移而有猝灭荧光团的倾向。所有linker都设计成，去除荧光团后的残留可最大限度地减少对双链DNA的扰动。

SBS通过可逆终止化学作用，使dNTPs碱基按序结合。天然聚合酶在 dNTP 结合之后不会暂停，结合速度快。一个关键的挑战是开发一种聚合酶来适应这种新的化学反应。

野生型聚合酶可以耐受3'-OH位点的修饰，但核苷酸的掺入速度较慢，并且需要高浓度的修饰核苷酸。开发的聚合酶必须比野生型更好地耐受3'- OH保护基团，同时表现出相当的结合动力学。研究人员设计并筛选了不同的聚合酶。通过对不同聚合酶上的三个关键氨基酸进行饱和诱变，选择了化学修饰dNTPs的合适酶。这种突变的聚合酶可以容纳并结合所有四种非天然dNTPs。

聚合酶还需要在加入正确的dNTP后更容易地从DNA链上脱落。在SBS中，由于3'-OH受到保护，因此在dNTP掺入之后暂停下一次结合。必须对聚合酶进行改造以保持dNTP结合的准确性和速度。因此，聚合酶上的两个或三个带正电的氨基酸在结合位点附近突变，但远离催化位点，这增加了解离常数(Kd)，增加了off-rate（Koff），使得测序方法可行。

为了对大型基因组进行测序，需要同时对数百万个较小但不同的片段进行测序，每条DNA模板链必须固定在固体表面上。由于SBS涉及dNTP结合的循环，以对每个固定的短读段进行测序，因此开发了表面和DNA附着化学，以承受测序反应条件的反复暴露，并避免正在测序的DNA链的丢失。开发的表面不能有背景荧光，否则会干扰dNTPs的荧光。另一个关键的挑战是防止荧光dNTP与表面的非特异性结合，以检测真正的核苷酸结合事件。Illumina测序平台在过去的20年里发生了巨大的变化，最新仪器中使用的表面化学尚未被报道。

以极高的灵敏度检测荧光团是另一个明显的挑战。研究团队开发了molecular clustering技术，旨在局部扩增表面固定的单个DNA片段，使其扩增成为数百个相同拷贝的集群。特定的adaptor连接在DNA片段的两端，然后通过adaptor互补序列杂交到表面。DNA聚合酶扩增导至DNA片段多个拷贝在局部产生，这是因为扩增的序列与另一个相邻的表面固定引物形成了一个桥式结构(下图)。这种桥式扩增策略多次迭代才优化成功纳入最终的工作流程。例如，DNA互补链间的再杂交速度很快，影响了它们对表面固定引物的杂交。这个问题最终通过表面的等温扩增解决。此外，染料的不均匀荧光背景阻碍了DNA集群的准确信号量化，需要使用局部概率元胞自动机方法。最后，该工作流程被设计成具有单分子灵敏度的大面积成像，确保每个簇在每个新的成像周期中保持对齐。光学系统是固定的，而装有待测序DNA池的平台是可移动的，因此可以对大面积成像，并且可以大规模并行测序(下图)，这种方式使信号的采集速度提高了一千倍。

NGS是一个例子，说明化学如何通过设计在反应性和选择性方面与天然化合物相媲美的非天然化合物，为生物学和医学提供新的强大工具。作者描述了化学开发技术的关键要素，包括荧光标记和保护的非天然dNTPs，一种新的DNA聚合酶，一种新的表面化学和一种局部扩增待测序DNA片段的独特方法，从而以最大限度地提高测序精度。NGS已被用于生命科学的各个领域，使识别诸如自闭症等疾病的风险基因成为可能，实现了蛋白质- DNA相互作用的全基因组定位，定量组织中的RNA转录。NGS通过揭示致病突变、提供指导治疗策略的关键信息以及使无创循环cfDNA分析成为诊断标记物来影响临床医学。它被用来破译病毒基因组，这对RNA疫苗的快速开发至关重要。NGS与RNA疫苗一起应用于冠状病毒，追踪变异，形成了应对大流行的基础。最后，NGS正在重塑我们对基因组进化的理解，为跨物种的未来进化趋势提供见解。

从它对生物学、医学和公共卫生的广泛影响来看，NGS说明了化学对新技术发明的核心作用。NGS的发展不仅是打破常规思考、冒险和许多失败实验的结果，而且是对使其成为一项成功技术的预先实现，以及识别沿途需要解决的关键问题的能力的结果。