识别血液循环中的生物标志物，并使用低成本和微创的方法进行检测，有望成为改善许多疾病的诊断和预后的突破性创新。在过去十年测试的几种方法中，许多研究证实了循环microRNAs (miRNAs)对阿尔茨海默病和其他疾病作为生物标志物的能力。许多潜在的生物标志物候选物已经被提出，但这些研究缺乏一致性，主要是因为在miRNA分析，比如逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)中缺乏方法进行归一化。当测量非细胞组织(如血液)中的DNA/RNA时，通常使用的内参(如GAPDH或β-肌动蛋白)在生理上不相关。使用内源性miRNA全局平均值作为内参进行归一化，在分析大量miRNA时是稳健的。然而，在较小规模的实验中，比如RT-qPCR，就必须另外选择最佳归一化内参。 近日，一组来自波兰的研究团队在杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Optimized RT‑qPCR and a novel normalization method for validating circulating miRNA biomarkers in ageing‑related diseases”的文章。文章中作者审视了使用RT-qPCR测定血浆miRNA的分析管道，并强调当前标准实践需要优化的领域，并提出建议。建议包括使用基于吸光度的算法检测样品溶血、使用双重外源对照来监测miRNA分离和逆转录步骤的效率，以及使用BestmiRNorm识别最佳归一化因子。作者使用BestmiRNorm验证了7种归一化因子，它们的组合在AD患者和健康对照中是稳定的。 图片来源：Scientific reports 主要内容 不同仪器及软件引入的RT-qPCR变异性 作者分析了140名受试者血浆样本中选定的miRNA水平，其中包括27名健康献血者和113名来自两个独立临床队列的受试者，包括非痴呆受试者、SCI受试者、早期和晚期AD患者(前驱AD即MCI-AD和AD)、MCI -非AD患者和其他形式痴呆(OD)患者。 作者首先比较了在两台不同的机器(StepOnePlus和7900HT)上对相同样本并行运行RT-qPCR，并使用两种不同的软件（SDS和ExSuite）分析结果。结果显示了不同的软件会影响基于spike-in变异性(图A)或广泛使用的溶血指标ΔCq (miR-23a-3p - miR-451a)被考虑排除的样本数量(图B)。不仅如此，miR-126-3p还表现出两个离散群体，这是由于不同的机器提供了不同的数据。这些数据清楚地表明，RT-qPCR结果的可变性可以通过机器和软件引入。因此，作者建议在整个研究中使用相同的机器和软件执行RT-qPCR分析的所有步骤，包括归一化。
Bialystok队列数据分析使用不同的机器和软件。 图片来源：Scientific reports 比较评估溶血的几种方法 作者进一步探索了广泛使用的ΔCq方法用于评估溶血的效用，并与基于吸光度的方法进行了比较。结果显示ΔCq (miR-23a, miR-451a) 和ΔCq (miR-23a, miR-16-5p)(图C,D)与基于吸光度的方法相比显示出非常差的相关性。
溶血检测变异性。图片来源：Scientific reports miRNA检测的外源对照 通常在miRNA分离或逆转录之前，添加spike-in miRNA外源对照，以证明反应效率，允许纠正或剔除不可靠的样品。作者的研究结果表明，与逆转录之前添加的外源对照的相比，miRNA提取之前加入的外源对照的Cq值显示出比较强的随机性（图E）。这个结果说明有必要使用至少两个外源对照来分别评估miRNA分离和逆转录的效率。对miRNA处理的每一步的双重对照是必要的，因为每个单独的miRNA spike-in的分离和逆转录可能会受到血浆样品的其他成分的不同影响。同时使用内源性归一化因子与外源性spike-in对照来提高实验结果的质量和可重复性是必不可少的。
miRNA检测的外源对照。图片来源：Scientific reports 最佳归一化内参组合的新算法BestmiRNorm 作者开发了一种称为BestmiRNorm的新方法，以确定最佳归一化因子。BestmiRNorm为每个归一化内参/组合计算-ΔΔCq(图A-C)，然后根据指定的指标对数据进行评分(图D)。一旦分配了排名，根据实验者对重要性的判断，可以将权重应用于每个指标(图E)。对单个加权指标进行求和，并使用最终排名来评估最佳归一化内参组合。
确定最优归一化因子的方案。图片来源：Scientific reports 最佳归一化内参组合 在对评分指标施加相同权重的情况下，下图A显示了所使用的两种不同qPCR仪的归一化内参排名分数比较。图B显示了在排名前10的组合中发现的特定归一化内参，其中miR-192-5p和miR-484存在于前10位组合中的9个中，表明它们特别稳定。对分数施加权重的结果表明，所有7个潜在归一化组合的平均值大致稳定。性能稳定的miR组合有117 (hsa-miR-192-5p, 126-3p, 16-5p, 484, 23a-3p)和84 (hsa-miR-192-5p, 24-3p, 126-3p, 484)。
Bialystok队列样本的归一化因子鉴定。 图片来源：Scientific reports 几种算法的比较 图A显示了使用最广泛使用的算法和新方法BestmiRNorm，比较三种归一化内参组合的排名。结果显示BestmiRNorm方法与Normirazor方法排名虽不同，但BestmiRNorm和Normirazor都发现了相同的3种归一化内参最佳组合(hsa-miR-192-5p, 24-3p, 484)。
Bialystok队列归一化因子的比较。 图片来源：Scientific reports RT-qPCR分析血浆源性miRNA的 最佳实验设计流程图 作者研究了分析循环miRNA的常见分析管道，并在可能引入可变性的关键步骤上提出了当前标准实践的优化。涉及以下qPCR步骤：分析前血液溶血样品的排除，添加外源miRNA作为miRNA分离和反转录的对照，以及归一化方法。下图总结了这篇文章推荐的标准化方法，以获得可靠的miRNA分析数据。 （1）建议将基于吸光度的算法作为评估溶血的首选方法。此外，对溶血状况的目视预先检查也是有用的。 （2）有必要使用至少两个外源对照来评估每一个步骤的效率：miRNA分离和逆转录(图6)。 （3）作者提出了BestmiRNorm方法，用于选择最佳归一化因子。BestmiRNorm是识别最佳归一化因子的新方法，可以高效地对多达11个归一化因子进行组合比较。
RT-qPCR分析血浆源性miRNA的最佳实验设计流程图。 图片来源：Scientific reports 总结与讨论 血液是诊断测试中最容易获得的基质之一，血浆循环miRNA作为许多衰老相关疾病(包括AD)的生物标志物显示出非常有希望的特征，但缺乏实施的主要原因之一是不同研究中RT-qPCR对照和miRNA分析规范化方法的差异。到目前为止，还没有基于RT-qPCR的miRNA分析的最佳归一化策略，也没有专门针对基于RT-qPCR的循环miRNA定量的指南。 为了促进miRNA生物标志物在研究和实验室之间从发现阶段到临床诊断的转化的比较，有必要对分析前和分析方法进行标准化。在这项研究中，作者提出了一种优化的分析方法，用于使用RT-qPCR获得可靠和可比较的血浆miRNA分析数据。并提出了以下措施的必要性：（1）评估样品的质量并根据吸光度指标排除溶血样品；（2）使用至少两种外源miRNA进行miRNA分离和逆转录的对照，并纠正这些步骤的效率；（3）使用计算效率高的BestMirNorm方法为数据分析选择最佳归一化因子。使用BestMirNorm方法，作者成功地选择并验证了七个稳定的归一化因子，并建议将其用于衰老相关疾病中miRNA的生物标志物检测。 |
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