IVD技术丨CRISPR方法用于液体活检中的miRNA定量检测

下图展示了非对称CRISPR级联信号扩增检测核酸靶点的工作原理。非对称CRISPR测定使用两组竞争性crRNA: i)靶向性全长crRNA和ii)独立的split crRNA。split crRNA由一个单独的5 '支架和一个3 '间隔组成。split crRNA被设计为特异性地结合其自身独立的ssDNA (split- T)，其序列与靶核酸不同。

在不对称CRISPR实验中，当两种crRNA和split- T混合时，由于与split crRNA相比，全长crRNA对Cas12a的结合亲和力更强，因此形成Cas12a/全长crRNA复合物，抑制了split crRNA与Cas12a的结合，即使在split- T存在的情况下，CRISPR-Cas12a也不能被激活(下图b)。在靶核酸存在的情况下，Cas12a/全长crRNA复合物被特异性激活并启动第一次反式切割反应。随后，split crRNA取代全长的crRNA，并重新激活Cas12a进行第二次反式切割反应，从而导至额外的荧光信号扩增。因此，非对称CRISPR检测通过单个CRISPR- cas12a在单管中提供了简单、快速、高灵敏度的核酸检测。

为了研究不同crRNA与CRISPR-Cas12a的结合亲和力，作者设计了一种靶向性的全尺寸crRNA和一种split crRNA，它们特异性地结合到DNA靶标的同一区域，以及两个竞争性全长crRNA和split crRNA，结合的目标序列与前述不同 (下图a)。

作者比较了靶向性split crRNA和全长crRNA在不同浓度竞争性全长crRNA下的反式切割活性。结果表明，随着竞争性全长crRNA浓度的增加，靶向性split crRNA的反式切割活性显著降低。相比之下，靶向性全长crRNA的反式切割反应不受显著影响。竞争性split crRNA对靶向性全长crRNA或靶向性split crRNA的反式切割反应均没有显著抑制(下图b)。这些结果表明全长crRNA比split crRNA对Cas12a具有更强的结合亲和力。电泳迁移试验结果也表明，全长crRNA由于具有更强的结合亲和力，可以调节split crRNA与Cas12a结合，并产生竞争性CRISPR反应（下图c）。

利用全长crRNA与split crRNA对Cas12a亲和力的差异，作者探索了通过CRISPR-Cas12a构象再激活进行高灵敏度核酸检测的级联信号扩增机制。结果证实，无论split crRNA是否存在，全长crRNA都可以发生靶标切割；然而，全长crRNA会抑制split crRNA的切割反应 (下图a)。这些结果表明，在两者存在的情况下，全长crRNA反应比split crRNA反应更优先发生。

根据实验结果和文献，作者假设全长crRNA激活 CRISPR-Cas12a切割反应后，split crRNA可以取代全长crRNA并与Cas12a结合，从而实现CRISPR的级联信号扩增反应。如下图c所示，没有靶标的情况下，即使增加split crRNA的浓度，全长crRNA仍然与Cas12a结合，不能被split crRNA取代。但当加入全长crRNA的靶核酸full-T时，Cas12a被激活，触发与全长crRNA的第一次反式切割反应。然后，split crRNA可以取代全长crRNA，与Cas12a结合，通过其split-T重新激活Cas12a，诱导第二次反式切割反应，导至级联信号放大。

为了通过CRISPR-Cas12a直接检测RNA，作者使用了两个片段化的核酸靶点，它们特异性地结合crRNA，并释放Cas12a的反式DNA切割活性(下图a)。结果显示，当只有ssDNA-activator或ssRNA/ssDNA-target存在时，反式切割活性不能发生。ssDNA 5 ' -activator /ssDNA 3 ' -target和ssRNA 5 '-target/ssDNA 3 ' -activator能够诱导Cas12a旁切活性，而ssDNA 5 ' -activator/ssRNA 3 '-target则不能。因此，ssRNA与crRNA的结合位置高度影响Cas12a的反式切割活性((图b-d)。

接下来，作者研究了是否可以通过非对称CRISPR检测进一步提高Cas12a的miRNA检测灵敏度，实现无扩增miRNA检测。作者设计了ssDNA 3 ' -activator，同时可以作为split crRNA靶标。还设计了一个split crRNA来识别部分DNA activator，以及一个同时结合miRNA和DNA activator的全长crRNA。结果显示，在不对称CRISPR实验中，在低浓度靶条件下，比如1 pM靶miRNA的终点荧光信号差异比无split crRNA时高29.2倍(下图f)。

如图g所示，加入split crRNA后，检测灵敏度较未加入split crRNA的情况有明显提高。随着miR-19a浓度从1 fM到10 pM，荧光强度线性增加。通过非对称CRISPR检测，可以获得miR-19a的LOD为856 aM，这比无split crRNA的CRISPR检测灵敏度高1000倍。因此，非对称CRISPR方法为无扩增、定量检测miRNA提供了一种简单、高灵敏度和特异性的方法。

最后，作者探讨了不对称CRISPR检测在miRNA液体活检中癌症诊断和预后的潜在效用，使用非对称CRISPR技术分析了膀胱癌患者血浆样本中miR-19a的表达水平(下图a)。

首先使用商用RNA提取试剂盒从10名膀胱癌患者和5名健康供体的血浆样本中提取总RNA，并与含有Cas12a/crRNA和split crRNA的反应溶液混合，实时测量荧光信号，计算每个血浆样品中靶miR-19a的浓度。结果证实了膀胱患者样本中miR-19a的总体表达水平高于健康供体样本(图b和d)，且此方法与RT-qPCR的结果具有良好的相关性。这些临床检测结果表明，非对称CRISPR方法可以简单、快速、无扩增地检测临床样品中的miRNA，灵敏度高，为其临床应用提供了经验支持。

这项研究中有两个主要的CRISPR发现:(i)全长crRNA和split crRNA之间的竞争反应可以提高CRISPR-Cas12a的检测灵敏度;(ii) Cas12a可以识别与crRNA互补的片段化RNA/DNA靶标，从而可以直接检测RNA。作者开发了一种用于核酸级联信号扩增检测的非对称CRISPR检测方法，并将其应用于临床肿瘤样本中定量检测miRNA，无需预扩增或逆转录。作者设计了split crRNA，靶向miRNA被选择性检测，LOD为856 aM(比无split crRNA的CRISPR检测灵敏度高1000倍)。本方法采用一种CRISPR酶单管一步等温信号扩增方法，对核酸的检测简单、灵敏、定量。此外，非对称CRISPR具有成本效益，每次检测的材料成本估计低至0.47美元。

尽管取得了令人鼓舞的结果，但在未来的研究中，不对称CRISPR检测可以从几个方面进一步扩展和改进，从而在资源有限的环境中实现即时检测。首先，为了简化人工操作，该分析可以进一步集成到微流控平台中，以实现自动样品制备和液体操作。其次，为了提高检测的单核苷酸序列辨别能力，可以利用和优化新设计的CRISPR酶和设计的crRNA。第三，为了消除对昂贵的荧光检测设备的需求，可以开发一种简单实惠的智能手机检测器，用于荧光记录和信号处理。总的来说，本研究突出了CRISPR-Cas12a反应系统的发现，为早期癌症诊断和传染病检测提供了一种强大的核酸检测方法，具有临床应用潜力。