作者尧灵 本文描述了注射器式、横卧式 和 小孔式 三种类型试纸条防污染装置。三种试纸条防污染装置将核酸扩增与试纸条检测结合于一体，在扩增完成后，通过简单的 摇动 或 按压 操作，使反应液与试纸条接触，反应液在试纸条上通过毛细作用迁移，从而达到在密闭空间内采用试纸条进行核酸检测的目的。
多数核酸恒温扩增在 60 °C 以上的温度条件下进行，为避免核酸恒温扩增过程中反应液蒸发对扩增本身及对试纸条检测造成的影响，本实验中采用石蜡油对扩增液进行密封。由于石蜡油具有粘性，因此可能影响扩增液在试纸条上的迁移。在开发密闭性试纸条检测装置之前，本文探究了不同石蜡油体积对试纸条检测的影响。如图 1 所示，当石蜡油过多时会影响水相样本在试纸条上的迁移。随着石蜡油体积的减少，水相样本在毛细作用下顺利沿试纸条迁移，并在试纸条上呈现出肉眼可见的条带，说明适量体积的石蜡油不会影响试纸条对水相的检测。同时若石蜡体积过少，则不能有效避免扩增样本在核酸恒温扩增过程中的蒸发。本文采用石蜡体积均为 15 μL。
图 1 1 横卧式试纸条密闭装置 其中 横卧式 和 小孔式 试纸条装置均包括反应管，横向流动试纸条容器和端盖。在完成组装后，装置内部可以形成完全密封的结构。反应管呈圆柱形，内径为 3 mm，高度为15 mm。横向流动试纸条容器的尺寸为 50 × 2 × 1 mm。所有组件壁厚为 1 mm。 在小孔式试纸条密闭装置中，反应管与横向流动试纸条容器之间的连通孔直径为 1.5 mm。 横卧式试纸条密闭装置如图 2a 所示。预先将试纸条插入试纸条容器并用端盖密封。同时将 25 μL 扩增液加入反应管中，并在扩增液上方滴加 15 μL 石蜡油对扩增液进行密封。将组装好的试纸条密闭装置置于恒温热块上进行扩增。 扩增完成过后，将装置从热块上取下并轻摇使反应液与试纸条接触。反应液沿试纸条迁移产生肉眼可见的条带，其中阳性样本在 C 线和 T 线处均有红色条带产生，而阴性样本只在 C 线处产生红色条带，如图 2b 所示。 
图 2 横卧式试纸条密闭装置 如图 3 所示，注射器式密闭试纸条装置包括反应管、注射器外管壁和注射器活塞三个部分，注射器活塞上的凸起设计用于固定试纸条。预先将试纸条固定在注射器的活塞凸起上。同时将 25 μL 配制好的扩增液加入反应管中，并用 15 μL 石蜡油对扩增液进行密封。将组装好的试纸条密闭装置置于恒温热块上进行扩增。扩增完成后轻轻按压注射器活塞，使试纸条末端浸入反应液中。在毛细作用下，反应液在试纸条上迁移，产生肉眼可见的红色条带。
3 小孔式试纸条密闭装置 通过减小横卧式试纸条密闭装置中反应管和检测容器之间的互连孔，可有效防止扩增样本的蒸发，实现非油封扩增。如图 4a 所示，互联孔设计为圆形，孔的直径为 1.5 mm。 为测试小孔式试纸条密闭装置的检测灵敏度，将同一批次配制的扩增反应液分别加入不同的小孔式试纸条密闭装置中。将小孔式试纸条密闭装置同时置于 63 °C热块上进行扩增，同时以未加模板的扩增体系作为对照。 扩增模板为转基因大米 DNA，每个样本中模板的初始浓度为 750 拷贝。分别在扩增第 10 min，20 min，40 min 和 60 min 将试纸条密闭装置从热块上取下并迅速转移到 4 °C 冰箱中以低温终止扩增反应。待所有样本扩增结束后，将装置轻轻摇晃，使反应液与试纸条接触并沿着试纸条迁移。 
图 4b 显示，在扩增 20 min 后纸条 T 线处呈现肉眼可见的红色条带，说明扩增20 min 后即可采用小孔式密封试纸条装置对初始浓度为 750 拷贝的转基因大米 DNA 进行特异性检测。随着扩增时间的延长，扩增子积累增多，试纸条 T 线处的红色条带颜色加深。实验结果说明将核酸扩增与试纸条检测集成在小孔式试纸条密闭装置中，试纸条依然保持较高的检测灵敏度。 对比显示，横卧式和小孔式试纸条密闭装置相对于注射器式试纸条密闭装置的设计较优，一方面避免了反应过程中扩增液的蒸发，另一方面操作更为简单，扩增完成后仅需要简单的摇动即可实现试纸条对扩增结果的终点检测。 | 
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