《Science Advances》:外泌体miRNA检测新技术

SORTER检测旨在实现肿瘤源性外泌体亚型的特异性识别和分类，以及肿瘤源性外泌体miRNA的原位敏感检测。SORTER包含多个并行过程(下图B)，包括肿瘤源性外泌体的条形码标记，靶向输入miRNA检测探针，以及肿瘤源性外泌体miRNA的原位分析，从而实现肿瘤源性外泌体中敏感和精确的单管miRNA检测。SORTER的两个重大创新是通过双表面蛋白引导的正交识别对肿瘤来源的外泌体进行选择性标记和分选，以及通过双链特异性核酸酶(DSN)催化的信号放大对miRNA进行原位敏感定量。

作者设计了CD63和EpCAM的变构适体探针，当两种探针在单个外泌体上协同识别时，将通过变构形成独特的正交条形码。未配对的适体探针无活性，因此无需冲洗多余探针，避免了冗长的纯化过程。作者还设计了一种智能脂质体探针，通过使用外泌体上的条形码与脂质体探针的互补标签，将miRNA检测探针导入肿瘤来源的外泌体，并使用脂质体探针封装的Au NFs和DSN扩增miRNAs的荧光信号，实现各种miRNA的原位敏感定量。

作者选择CD63适体进行外泌体的鉴定和分离，以及选择EpCAM区分肿瘤和正常细胞来源的外泌体，即使用CD63和EpCAM双表面蛋白协同进行识别和分选肿瘤源性外泌体。

为了确认CD63和EpCAM是否在单个肿瘤源性外泌体表面共表达，作者使用TIRFM显微镜对双标记肿瘤和正常来源外泌体进行了成像。下图B表明CD63和EpCAM蛋白在单个肿瘤源性外泌体表面表达并共存，CD63和EpCAM探针可以在同一囊泡表面有效标记。

为了验证外泌体上锚定的条形码和胆固醇标记的互补DNA标签的相互作用，作者通过TIRFM进行了分析并确认了在单个外泌体表面上正交条形码和标签的拉链状杂交（下图E）。这些结果表明，正交条形码在囊泡表面具有良好的结构稳定性。

脂质体上的DNA标记与肿瘤源性外泌体上的条形码之间的杂交反应指导了脂质体与外泌体的靶向融合。作者使用基于FRET的检测方法监测膜融合(下图A)。融合后，膜表面荧光基团团之间的FRET效率下降（下图B）。

作者进一步使用TIRFM验证脂质体和外泌体的有效融合，结果显示分别标记荧光素的脂质体和外泌体在镜下共定位良好，随机融合中几乎没有观察到可检测到的共定位荧光信号。采用动态光散射(DLS)方法测定不同时间膜融合产物的尺寸分布。融合后的囊泡直径从154.7 nm逐渐增大到206.5 nm，而在对照实验中，囊泡直径几乎没有增加。这些结果表明，双表面蛋白介导的正交融合是有效的，允许引入封装的miRNA检测探针进行下游分析。

作者使用外泌体miR-21来评估SORTER性能。如下图B所示，Tags-Lipo@Au NFs孵育后肿瘤来源的外泌体LNCaP Exo的荧光信号显著增强；对照组BPH-1 Exo几乎没有信号变化。此外，NanoFCM和TIRFM结果(下图C和D)进一步表明，肿瘤LNCaP Exo的荧光明显高于BPH-1 Exo。这些结果表明肿瘤外泌体中miR-21水平升高。

测量三种PCa细胞(PC-3、LNCaP和DU145)和一个BPH-1来源的外泌体的六种miRNA的表达水平来表征SORTER的性能，包括miR-21、miR-222、miR-1290、miR-221、miR-10b和miR-182。实验结果显示，这些miRNA在肿瘤源性外泌体中的表达明显高于正常BPH-1外泌体，RT-qPCR与SORTER之间的相关系数为0.9200。且实验证明SORTER的高灵敏度可以直接在前列腺癌患者血浆中检测到低水平的外泌体miR-21。

为了评估SORTER在诊断前列腺癌中的临床应用性能，作者收集了30例涉及前列腺癌(n = 20)和年龄匹配的BPH (n = 10)的患者的血浆样本。使用这些样品(每个血浆样品0.2 μl)，作者使用SORTER检测进行多参数miRNA分析。作为比较，在临床队列中也进行了CD63+或EpCAM+单靶点进行miRNA分析。

通过无监督分层聚类分析，作者研究了每个患者的6个miRNA是否在不同的EV亚群中表现出相似的表达模式。表达热图显示，在不同EV亚群中，各miRNA的丰度具有相当大的异质性。6种miRNA在PCa中与BPH血浆样本相比显著上调。结果显示，CD63+外泌体区分PCa与BPH的灵敏度50.0%，特异性90.0%，准确性76.7%；EpCAM+外泌体区分PCa与BPH的灵敏度90.0%，特异性100%，准确性96.7%；而SORTER使用CD63+EpCAM+ 的外泌体区分PCa与BPH的灵敏度为100%，特异性为100%，准确性为100%。这些结果均表明SORTER可以提高基于外泌体的液体活检的诊断检测性能。

作者收集了74名参与临床队列的患者的血浆，包括nPCa (n = 27)，转移性PCa (mPCa, n = 20)和BPH (n = 27)。作者测试了六种miRNA (miR-222、miR-1290、miR-182、miR-21、miR-221和miR-10b)的外泌体特征，使用SORTER方法可以区分前列腺癌(PCa)和良性前列腺增生(BPH)，在训练队列中灵敏度为100%，特异性为100%，准确性为100%。训练队列中所有的nPCa和mPCa病例都被正确检测到，总体准确率达到100%。

SORTER方法进一步应用于独立验证集。在验证队列中，PCa特征能够以100%的灵敏度、特异性和准确性区分PCa和BPH。只有2个mPCa和1个nPCa被错误分类，导至总体准确率为90.6% (下图H)。总的来说，这些比较结果进一步表明，SORTER方法具有潜在的分子表型适应性，并提高了早期癌症的诊断性能。

在这项研究中，作者首次提出了一种SORTER方法，结合了双表面蛋白协同识别来精确标记未提取血浆样本中的肿瘤来源外泌体。与传统的鉴定/分离技术不同，SORTER最大限度地减少了非特异性囊泡和自由分子的干扰，从而能够快速准确地识别血浆样品中肿瘤来源的外泌体，避免冗长的预分离/纯化程序。值得注意的是，并非所有的肿瘤源性外泌体都表达CD63和EpCAM标记物，因此在本工作中仅对一部分肿瘤源性外泌体进行了标记和分析。这种现象对外泌体miRNA检测的灵敏度提出了更高的要求。

SORTER具有以下三个值得注意的优点:首先，SORTER无需外泌体提取和RNA制备过程，这大大简化了实验操作，减少了处理时间，防止样品损失。其次，该技术精确分类和分析肿瘤来源的外泌体，提高了外泌体基于miRNA液体活检的诊断和预后准确性。第三，该技术只需要小体积血浆样品(~0.2 μl)，跳过冗长的预分离/纯化过程，检测时间短至~2小时，具有96/384孔板的高通量兼容性，为无创、高精度的癌症筛查和进展监测开辟了道路。由于SORTER具有在临床血浆样本中区分肿瘤来源外泌体的强大能力，因此SORTER可以很容易地扩展到测量miRNA之外的其他不同分子(例如，内部蛋白质、脂质和代谢物)。通过设计变构适体探针，可以很容易地增强该技术的条形码能力，从而可以测量其他分子亚型的EV(例如，不同的细胞来源)。SORTER将有助于液体活检领域的发展，并在复杂的临床环境中成为疾病筛查、分类和进展监测的临床可行工具。