新实施！临床微生物培养、鉴定和药敏检测系统的性能验证（2023版） ...

本标准规定了临床微生物形态学检查、培养、鉴定、药敏、分子即时检测等系统性能验证的要求。本标准适用于开展临床微生物检验的医学实验室。

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 标准。

GB 19489 实验室生物安全通用要求

WS/T 442 临床实验室生物安全指南

WS/T 639 抗菌药物敏感性试验的技术要求

WS/T 640 临床微生物学检验标本的采集和转运

下列术语和定义适用于本标准。

3.1参考方法 reference method

一种无系统误差，随机误差可控，且准确清晰地描述了测定一个或多个性能参数的检测方法，可用于评估其他检测方法的性能。

3.2比对方法 comparator method

用于评估新系统的方法， 包括参考方法或已获得药监局批准的商品化方法。

3.3接种物浓度 inoculum

接种于微生物检测系统的菌悬液中微生物的浓度，以每毫升菌落形成单位（colony-forming units per milliliter，CFU/mL）表示。

3.4标准菌株 reference strain

由菌种保藏机构保藏，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。

3.5性能验证 verification

通过提供客观证据，确认微生物检测系统在用于患者标本及标本分离株检测之前能达到与制造商 说明书一致的性能。

3.6能力验证 proficiency testing；PT

利用实验室室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力（ISO/IEC 17043, 3.7）。

注：能力验证活动包括获认可的能力验证提供者的能力验证计划， 以及卫生系统权威机构提供的比对（实验室间质量评价）。

3.7准确度 accuracy

测量值和真实值之间的一致性接近程度。本标准用以描述准确鉴定同一待测菌的能力或准确确定 同一待测微生物/抗微生物药物组合敏感性结果的能力。

3.8精密度 precision

在规定条件下，对同一或相似被测对象重复测量得到的测量示值或测得量值的一致程度。 

3.8.1可重复性 repeatability

在一组测量条件下，包括相同检测程序、相同操作者、相同测量系统、相同操作条件和相同地点， 短时间内对同一或相似被测对象重复测量的精密度。

3.8.2再现性 reproducibility

在包括了不同的地点、不同的操作者、不同的测量系统的测量条件下对同一或相似被测对象重复测 量的精密度。

3.9符合率 agreement rate

采用不同方法对同一待测物定性检测结果的一致程度，也称一致率。

3.10定量限 limit of quantitative；LOQ

在规定的实验条件下，样品中待测组分能以规定的准确度（作为总误差或作为偏差和精密度的特定要求） 被定量测定的最低量值。

3.11检出限 limit of detection；LOD

指某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量。 

3.12最抑菌浓度 minimal inhibitory concentration；MIC

在琼脂或肉汤稀释法药物敏感性检测试验中， 能抑制肉眼可见的微生物生长的最低药物浓度。 3.13分类一致性 category agreement；CA

被评估的药敏方法与参考方法或比对方法相比，判断结果为敏感、中介、剂量依赖性敏感和耐药的一致性。

3.14基本一致性 essential agreement；EA

待测系统MIC值与参考方法或比对方法MIC值相差不超过1个对倍稀释度（细菌）或2个对倍稀释度 （酵母菌） 。待评估方法为纸片扩散法时，不计算EA。

3.15极重大偏差 very major discrepancy；VMD

待评估的药敏系统检测为敏感， 而现有商品化检测系统检测为耐药，即假敏感。 

3.16极重大误差 very major error；VME

待评估的药敏系统检测为敏感， 而参考方法检测为耐药， 即假敏感。

3.17重大偏差 major discrepancy；MD

待评估的药敏系统检测结果为耐药， 而现有商品化检测系统检测为敏感，即假耐药。 

3.18重大误差 major error；ME

待评估的药敏系统检测结果为耐药， 而参考方法检测为敏感， 即假耐药。

3.19小偏差 minor discrepancy；MD

待评估的药敏系统将现有商品化检测系统的中介判为敏感或耐药、或者将耐药或敏感判为中介。 3.20小误差 minor error；ME

待评估的药敏系统将参考方法的中介判为敏感或耐药、或者将耐药或敏感判为中介。

3.21专家系统 expert system

提示非典型或异常药敏结果的抗微生物药物敏感性的分析软件。

3.22即时检测 point-of-care testing；POCT

亦称近患检验（Near-patient testing），在患者附近或其所在地进行的、其结果可能导至患者的 处置发生改变的检验。

3.23临界值 cut-off value

作为判断特定疾病、状态或被测量存在或不存在的界限的数值或量值。

3.24正确度 trueness

多次重复检测所得量值的平均值与一个参考量值间的一致程度。通常用“偏倚”表达， 是对系统误 差的衡量。

4.1  风险评估是评估危害发生的概率和危害严重程度。风险评估应考虑到错误结果、结果延迟、结果 缺失或治疗延误的风险。

4.2  错误检测结果带来的风险

新检测系统未执行全面验证方案或现有系统部分改变时未执行部分验证方案，可能造成鉴定错误、 药敏检测错误等，从而给患者带来一定风险，详见表1。错误结果带来的风险因致病菌种类或菌种/药物 组合而异，如漏检苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌（假敏感）所带来的风险较将大肠埃希菌氨苄西林报 告为假耐药更为严重。当错误结果带来的风险较高时，实验室应增加附加检测试验。

表1    微生物检测系统错误结果所带来的风险

4.3  验证样品量、样品类型带来的风险

验证样品量或验证类型不足带来的风险包括：

a)  分离培养系统标本多样性不足， 不能准确判断相应标本各类目标菌种的分离概率。

b)  培养、鉴定系统入选菌种或标本多样性不足， 不能鉴定同一属细菌亲缘关系近的菌种；对于少 见菌、不常见菌可能造成漏检或错误鉴定。

c)  验证药敏检测系统时，不覆盖耐药或中介的菌株或折点附近的菌株，可能产生较高的 VME、ME。d)  选用的菌株均是低 MIC 或高 MIC 值的菌株，易造成系统验证结果偏差。

5.1  性能验证应在以下情况下执行， 具体不同的检验项目见本标准各章条内容。

性能验证应在以下情况下执行：

a)  检验程序常规应用之前。

b)  任何严重影响检验程序分析性能的情况发生后，应在检验程序重新启用前对受影响的性能进 行验证。

5.2  验证后的质量保证

常规使用期间，为能满足检验结果的预期用途，可基于检验程序的稳定性，利用日常工作产生的检 验和质控数据， 定期对检验程序的分析性能进行评估。包括但不限于如下：

a）持续的质量控制（quality control，QC）。

b）能力验证（PT）/室间质评不适用时， 采用替代方法，应至少每半年评估一次准确度。

c）人员的培训和能力测试：定期评估人员的检测能力，如培训新出现的耐药表型、分类学变化和 折点的更新等。

d）仪器和软件维护：检测到仪器和软件的问题应采取相应措施， 并跟踪评价纠正措施。e)  按照制造商使用说明书要求进行年度评估。

f）异常结果的再审核：如药敏专家系统鉴定的异常结果应进行其他确认试验。确认后的异常结果 （如新的耐药表型） 应及时上报负责人。

6.1  染色方法的性能验证

6.1.1  验证时机

实验室使用新的染色方法前、 更换厂家或品牌后应进行性能验证。

6.1.2  验证菌株

实验室常用的细菌、真菌形态学显微镜检查项目有：革兰染色、抗酸染色(萋尼法、荧光法)、弱抗 酸染色、墨汁染色、真菌钙荧光白染色、乳酸酚棉蓝染色和六胺银染色等。标准菌株、QC菌株或经过明 确鉴定（如质谱或DNA序列分析确定）的临床菌株均可用于染色方法的性能验证。常用染色方法性能验 证所使用的菌种及性能特点见表2。

每项染色应至少选择5株菌，包括不同染色性能和形态特征的菌株。

表2    常用染色方法性能验证所使用的菌种及性能特点

6.1.3  验证前准备工作

菌株要求：验证用细菌、真菌或分枝杆菌等应在相应培养基上复苏、传代后，使用新鲜（对数生长 期）的纯菌落。

人员要求：所有从事涂片染色镜检的工作人员均需接受各种染色方法标准操作的培训，且需进行辨 色力检查。

6.1.4  验证方案

6.1.4.1  验证过程

由本岗位人员进行菌株传代、菌落涂片、染色和镜检， 填写性能验证记录表，明确记录各种染色方 法的实际性能特点。

6.1.4.2  可接受标准

若全部菌株符合预期染色性能特点， 则验证通过。

6.2  显微镜检查的性能验证

6.2.1  验证时机

检验程序常规应用之前。任何严重影响检验程序分析性能的情况发生后，应在检验程序重新启用前 对受影响的性能进行验证。现用检验程序的任一要素（仪器、染液等） 变更，应重新进行验证。

6.2.2  验证标本

6.2.2.1  验证标本的类型

所有标本及容器应当作具有传染性的物质， 应按照实验室生物安全要求操作（参见 GB 19489 和 WS/T 442）。优先使用已知结果的留样标本， 不可获取时可采用模拟标本。各种检查项目的标本类型：

a)  革兰染色适用于除血液、导管、粪便、喉部标本外的各种标本。

b)  抗酸染色适用于除血液和导管外的各种标本。

c)  弱抗酸染色主要适用于呼吸道、中枢神经系统、脓液等标本。

d)  墨汁染色用于脑脊液标本。

e)  真菌钙荧光白染色用于除血液、导管外的各种标本。

f)  六胺银染色主要用于呼吸道和组织标本。

g)  乳酸酚棉蓝染色适合丝状真菌培养物。

6.2.2.2  验证标本的数量

每项检查至少选择5份标本进行验证， 各染色项目对标本选择的要求如下：

a)  革兰染色：应覆盖革兰阳性菌、革兰阴性菌、未查见细菌等结果的标本。

b)  抗酸染色、弱抗酸染色、墨汁染色：应覆盖各种染色阳性、阴性结果的标本。

c)  真菌钙荧光白染色：应覆盖真菌孢子、真菌丝、假菌丝、未查见真菌等结果的标本。d)  乳酸酚棉蓝染色：应覆盖丝状真菌（如曲霉菌属） 的标本。

e)  六胺银染色：宜覆盖肺孢子菌的标本。

6.2.3  验证前准备工作

设备要求：细菌、真菌形态学检查涉及的设备如普通离心机、细胞离心机、自动染片机、显微镜等 均需进行日常维护保养及例行校准， 确保设备的性能稳定。

人员要求见本标准第6.1.3条。

6.2.4  验证方案

6.2.4.1  验证过程

由本岗位人员进行涂片、染色、镜检及结果报告， 由专人进行结果统计，评价检测结果与留样（模 拟） 样品之间的符合率。

6.2.4.2  样品的制备要求

所有样品的制备均需在生物安全柜内进行。适合直接涂片的临床标本应挑选脓性或带血部分，涂成 均匀薄片。尿液、胸腹水等体液标本离心后取沉淀物涂片。肺泡灌洗液、无色透明的脑脊液等用细胞离 心机离心制片。

6.2.4.3  结果报告

6.2.4.3.1  镜检观察视野的要求

痰涂片质量评估需低倍镜下观察最少20～40个视野。萋尼法抗酸染色若阴性需观察油镜下300个视 野， 报告1+时至少观察300个视野，报告2+至少观察100个视野， 3+、4+时至少观察50个视野。荧光法抗 酸染色若阴性需观察50个视野， 报告2+至少观察50个视野，3+及以上的阳性结果至少观察20个视野。

6.2.4.3.2  数量的报告

数量的报告如下：

a)  革兰染色细菌半定量报告：0～1 个/油镜， 1+；2～5 个/油镜，2+；6～30 个/油镜，3+；＞30 个/油镜， 4+。痰涂片标本应计算有细胞视野的细胞平均数量，分别记录低倍镜下鳞状上皮细 胞、多形核白细胞的数量，评估痰标本质量是否合格（若多形核白细胞数量＞25 个/LPF，鳞 状上皮细胞数量＜10 个/LPF，即痰标本质量合格） 。

b)  萋尼法抗酸染色观察 300 个视野（油镜） 若未发现抗酸杆菌， 报告抗酸杆菌阴性；1～8 条抗 酸杆菌/300 视野,报告抗酸杆菌数量（若 1～2 条抗酸杆菌/300 视野， 不确定，需重复试验)；1～9 条/100 视野， 报告抗酸杆菌 1+；1～9 条/10 视野，报告抗酸杆菌 2+；1～9 条/每视野， 报告抗酸杆菌 3+；＞9 条/每视野，报告抗酸杆菌 4+。

c)  荧光法抗酸染色观察 50 个视野（高倍） 若未发现抗酸杆菌，报告荧光染色抗酸杆菌阴性；1~ 9 条/50 视野，报告荧光染色抗酸杆菌数量；10～49 条/50 视野，报告荧光染色抗酸杆菌 1+；1～9 条/1 视野， 报告荧光染色抗酸杆菌 2+；10～99 条/1 视野， 报告荧光染色抗酸杆菌 3+；100 条及以上/1 视野，报告荧光染色抗酸杆菌 4+。

6.2.4.3.3  形态学描述

形态学的描述如下：

a)  革兰染色：报告每种菌体的染色特征（阳性、阴性）、形态（杆菌、球菌）、排列（成对、四 联、短链或长链等） 。

b)  墨汁染色：描述菌体特征（出芽、荚膜等）。

c)  六胺银染色：描述肺孢子菌包囊特征（椭圆形或半月形包囊，特征性圆括号样结构的囊壁）。

d)  其他真菌相关染色：描述真菌孢子、菌丝形态以及某些丝状真菌的产孢结构等。

6.2.4.4  可接受标准

半定量染色的结果偏差≤±1判断为结果一致。革兰染色、抗酸染色项目符合率应为100％；其他少 见染色项目符合率≥80％即合格。

6.3  自动化染片机的性能验证

6.3.1  验证时机

自动化染片机在投入使用前应通过性能验证。仪器搬迁、仪器故障维修后、仪器更新升级、更换新 品牌的染液，应重新进行验证。

6.3.2  验证标本或菌株

自动化染片机的性能验证宜选择临床标本或菌株（标准菌株、 QC菌株或经过明确鉴定的临床菌株） 进行性能验证。应满足：

a)  革兰染色适用于除血液、导管、粪便、喉部标本外的各种标本，至少 5 份；菌株应覆盖革兰阳 性菌、革兰阴性菌， 至少 5 株。

b)  萋尼法抗酸染色适用于除血液和导管外的各种标本，至少 5 份；菌株应覆盖抗酸阳性菌、抗酸 阴性菌，至少 5 株。

6.3.3  验证前准备工作

检查仪器状态， 包括喷嘴、冲洗管路、容量、废液排空等是否符合要求。

6.3.4  验证方案

6.3.4.1  验证过程

留样标本同时制备两份；菌株选择生长对数期的纯菌落配制0.5麦氏单位菌悬液涂片两份， 并分别 进行手工染色和自动化染片。

6.3.4.2  镜检与结果记录

分别记录各种菌株、各种标本分别在手工染色和自动化染片两种方法中的实际染色性状。

6.3.4.3  可接受标准

各标本或菌株染色结果与预期染色性能符合率为100％。

7.1  培养基的性能验证

7.1.1  细菌、真菌分离培养常用培养基的性能验证 

7.1.1.1  验证时机

培养基的性能验证应在首次启用新种类培养基前和更换厂家或品牌后。

7.1.1.2  验证用标准菌株和培养基

7.1.1.2.1  常用培养基性能验证所使用的标准菌株、性能特点及作用

将不同种属的细菌或真菌接种在相应培养基上，观察细菌或真菌的生长情况及性能特点，进行培养 基的性能验证。若不能获得相应标准菌株时，可采用经过准确鉴定并且性能特点符合表3要求的质控菌 株或临床分离菌株进行性能验证。常见标准菌株/质控菌株的培养与保存见附录A.1。

表3 常用培养基性能验证所使用的标准菌株、性能特点及作用

7.1.1.2.2  培养基性能验证数量

对于新启用的培养基，每种类型使用2个培养基进行性能验证。如为选择性培养基， 应覆盖不同生 长特性的菌株。

7.1.1.3  验证方案

7.1.1.3.1  验证过程

根据培养基种类选择合适的验证菌株，复苏、传代以获得新鲜的纯菌落。挑取纯菌落， 按实验室操 作程序规定的方法进行接种和培养， 在相应的培养条件、培养时间内进行结果观察和记录。

7.1.1.3.2  可接受标准

标准/质控菌株在相应培养基上生长，若符合性能特点，验证通过，可用于临床标本检测。如果直 接接种法时，验证未通过，则改用标准化菌悬液进行再验证， 以满足性能特点的要求。未进行性能验证 或性能验证未通过的培养基不能用于临床检测。

7.2  自动化接种仪的性能验证

7.2.1  验证时机

自动化接种仪在正式投入使用前应进行性能验证。仪器主要部件故障、升级等情况时也应进行性能 验证。

7.2.2  验证标本

实验室应至少对其所用自动化接种仪接种的标本类型进行性能验证。对于痰、粪便等质地较为粘稠 的标本，在采用自动化接种仪接种之前， 应做好标本的前处理。对于脑脊液等量少的标本、体积较小的 活检组织以及导管等标本不宜使用自动化接种仪进行接种。

标本数量：模拟标本10个，临床标本（包括尿、痰、胸腹水等）10个。

7.2.3  验证方案

7.2.3.1  验证过程

首次对自动化接种仪进行性能验证应以手工接种法为参照，比较其对标本分离的有效性。即对同一 标本， 分别采用两种方法（仪器法和手工法） 进行接种， 对最终分离出的菌种数、每种菌的单个菌落数 量、定量或半定量结果分别进行统计学比较。

对于尿液，可使用生理盐水， 将大肠埃希菌ATCC 25922配制成不同浓度（103 CFU/mL、104 CFU/mL、 105  CFU/mL和106  CFU/mL）的菌悬液， 制作成模拟标本，分别使用密涂法进行接种， 并与仪器法的定量 结果进行比对。

7.2.3.2  结果判读

7.2.3.2.1  尿液和肺泡灌洗液标本

在接种相同浓度菌悬液的情况下，进行菌落计数， 比较仪器法和手工法的差异。

7.2.3.2.2  除尿液和肺泡灌洗液外的其他类型标本

半定量结果判读标准如下：只在一区有菌落生长为+；只在一区和二区有菌落生长为++；同时在一 区、二区和三区有菌落生长， 且三区的菌落数＜5个为+++；同时在一区、二区和三区有菌落生长， 且三 区的菌落数＞5个为++++。

确定半定量结果之后，比较仪器法和手工法的差异。

7.2.3.3  可接受的标准

对于尿液和肺泡灌洗液等定量标本，若仪器法的菌落计数结果与手工法在同一数量级，则视为性能 验证通过；对于其他半定量培养标本， 若仪器法的半定量结果与手工法相差一个+，则视为性能验证通 过。

7.3  全自动血培养系统的性能验证

7.3.1  验证时机

全自动血培养系统的性能验证应在新系统投入使用前、系统主要部件故障、系统整体更新或升级后 进行，评估与全自动血培养系统配套使用的血培养瓶以及相应的自动化监测设备是否能在规定时间内 检出临床常见微生物（包括需氧菌、厌氧菌、苛养菌、酵母菌等） 。

7.3.2  验证菌株

标准菌株、 QC菌株及经过明确鉴定的临床菌株均可用于对全自动血培养系统的性能验证。

验证每类血培养瓶的菌株数均应至少5株。需氧瓶和儿童瓶均应覆盖专性需氧菌、兼性厌氧菌、苛 养菌和酵母菌4个种类；厌氧瓶应覆盖专性厌氧菌和兼性厌氧菌2个种类；真菌瓶应覆盖酵母菌和兼性厌 氧菌， 分枝杆菌瓶应覆盖分枝杆菌属细菌（表4）。具体菌株可以不限于表4中所列菌种。

表4    用于不同血培养瓶性能验证的菌株种类和名称

7.3.3  验证方案

7.3.3.1  细菌和酵母菌的稀释和接种

将菌株分别接种至对应的培养基，传代、分纯后并进行系列稀释：首先制成浊度为0.5麦氏单位的 菌悬液（细菌浓度为108 CFU/mL，酵母菌浓度为106 CFU/mL）,经适当比例稀释后，获得菌悬液浓度为102 CFU/mL，接种适量菌液于血培养瓶中，最终血培养瓶中的菌量为5～30 CFU/瓶。分枝杆菌的培养、稀释 应在符合生物安全的条件下进行（参见GB 19489和WS/T 442）。

7.3.3.2  血培养瓶中菌株实际接种量的确定

取上述经过稀释、浓度为102 CFU/mL的适量菌液分别接种到合适的平板上，均匀涂布在培养基表面， 接种后的平板置于合适的条件下培养，如将嗜血杆菌接种并涂布到巧克力琼脂培养基上，在CO2孵箱中 培养 24 h～48 h后进行菌落计数。计数得到的菌落数即是实际接种至血培养瓶中的菌量。

7.3.3.3  检测与结果记录

将定量接种菌液的血培养瓶，置于全自动血培养系统内培养。当阳性瓶报警后，转种合适培养基。培养后的纯菌落形态应与接种至血培养瓶前的形态一致，且经鉴定确认菌种的一致性。记录不同菌株实 际接种至血培养瓶中的菌量（CFU/瓶）和仪器检测到菌株生长时所需的时间（h）。

7.3.3.4  可接受标准

当全自动血培养系统能够在厂家规定的时间内，80％（5株菌中至少4株菌）以上可准确检出即通过 验证。如果验证的5株菌中有≥2株不能在规定时间内检测出来， 则视为验证不通过， 需要寻找原因，重 新进行性能验证。未通过性能验证的设备，不得用于临床检测。

7.3.3.5  需要注意的事项

如下：

a)  采用苛养菌做性能验证时，血培养瓶内宜添加适量新鲜、无菌的正常人血或动物血。b)  针对厌氧菌进行性能验证时，尽可能减少厌氧菌暴露于空气的时间。

c)  对含有抗微生物药物吸附剂的血培养瓶进行药物吸附的性能验证时，应遵从厂家的建议。d)  如果厂商说明书提供了其血培养系统的检出限，实验室宜进行检出限的验证。

8.1  手工、半自动和自动化鉴定系统

8.1.1  验证时机

实验室引入新的商品化检测系统，使用前应进行全面验证。

实验室使用中的检测系统，对样品类型、试剂、数据库、分析软件和硬件等进行升级后，在原有检 测病原谱基础上增加新的病原体扩大检测范围后， 应进行部分验证（表5）。

表5    微生物鉴定系统和药敏检测系统性能验证设计要求

8.1.2  验证菌株

结合厂家说明书和本地区/实验室微生物流行病学数据，选择标准菌株、QC菌株、经质谱或分子等 确认DNA序列的临床常见菌（覆盖80％以上种类）， 每种鉴定板至少测试30株分离株，以涵盖最常分离 的微生物。适用时， 可增加对少见菌、厌氧菌、苛养菌等的验证。一些大型医院， 其患者复杂、 分离的 微生物种类多，这些医院宜纳入更多的菌株。对于特定地区和机构, 考虑到特殊标本不易获取以及患者 等因素，可适当调整验证菌株。

注1：制造商在设备数据库中列出了可鉴定的微生物清单，这些微生物可作为验证的目标菌。注2：目标微生物范围较窄的检测板（如厌氧菌鉴定卡），可选3～5株菌。

8.1.3  验证方案

8.1.3.1  精密度（再现性）验证

8.1.3.1.1  对于微生物鉴定系统的精密度测试，应比较患者分离株的鉴定结果， 而不是单独的某一生化反应

全面验证：至少应在三个工作日，重复对五个菌株（QC和/或临床菌株）进行测试。例如， 可以选 择和测试3个QC菌株和2个临床菌株。由一名或多名操作员进行日间测试。

部分验证：1天测试3次适用于本次方法学变更的QC菌株。

8.1.3.1.2  可接受标准

全面验证：在3个工作日测试5个菌株（QC和/或临床菌株） ，至少14个鉴定结果一致，验证通过。部分验证：QC菌株鉴定结果应全部符合。

8.1.3.2  准确度验证

8.1.3.2.1  按厂家说明书对验证菌株进行种属鉴定

鉴定结果与实验室现用方法或参考方法如DNA序列分析比较准确度。如新系统的数据库包括现有系 统中未包括的微生物种类，可考虑使用其他方法对这些微生物进行附加测试。

全面验证：至少30个临床菌株；与现有系统或参考方法进行比较。

部分验证：至少10个临床菌株。

8.1.3.2.2  可接受标准

评价鉴定结果符合率时只比对鉴定结果， 无需对得分（如鉴定百分率）进行评估。准确度是以正确 的或可接受鉴定的菌株数/测试的分离物总数来计算。如果新系统等于或优于现有系统，则认为该测试 通过验证。验证的标准/QC菌株准确度应为100％， 临床菌株的准确度应在90％以上。

验证未通过时需要采取纠正措施。在采取纠正措施（包括与制造商进行讨论）后，应再次进行验证。微生物鉴定系统的性能验证指标、要求、方法和可接受标准见附录B.1。

8.2  MALDI-TOF MS 质谱鉴定

8.2.1  验证时机

实验室引入新系统时，使用前应进行全面验证。实验室使用 MALDI-TOF MS 后，若对试剂、数据 库、分析软件和硬件等进行更换或升级以及扩大检测范围，应进行部分验证。在设备状态、环境、检测 方法、人员等维持稳定的情况下，可采用文件和数据审核等定期评审分析系统状态，无需每年实施性能 验证。

性能验证包括准确度和精密度。通过 MALDI-TOF MS 和现用方法或参考方法（如测序方法）获得的 病原体鉴定结果进行比较以实现准确度验证。精密度验证应包括所有可能存在的主要变量，如不同的培 养基、培养条件和提取技术， 通常用标准菌株或QC菌株进行精密度验证；应评估批内、批间，操作者之 间以及连续几天的重复性或再现性。

8.2.2  验证菌株

选择的菌种应在 MALDI-TOF MS 制造商公布的可鉴定菌谱范围内， 包括革兰阳性及阴性球菌、革兰 阳性及阴性杆菌、苛养菌、厌氧菌、分枝杆菌属和真菌等。宜覆盖本地区、本实验室以往检出的特殊病 原菌， 不同地区或专科医院可适当调整。

8.2.3  验证方案

8.2.3.1  准确度验证

8.2.3.1.1  验证过程

全面验证：常见病原菌如革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、酵母菌， 每类别至少验证30 株， 厌氧菌、苛养菌、分枝杆菌属（如开展）、丝状真菌（如开展） 每种至少10株。比较 MALDI-TOF MS 鉴定结果与实验室现用方法或参考方法（如测序方法）之间的符合率。

部分验证： 选择10株以上目标种类病原体。

8.2.3.1.2  可接受标准

验证的标准/QC菌株符合率应为100％，临床菌株的符合率应在90％以上。对质谱技术难以准确鉴定 的特定菌种如某些快生长分枝杆菌、链球菌属某些种、志贺菌属等，应在检验程序适用范围中明确告知。

若未能满足上述验证要求，应采取相应措施。修正后的检测系统应再次进行验证。对错误结果的原 因分析见附录B.2。

8.2.3.2  精密度（再现性）验证

8.2.3.2.1  验证过程

全面验证：选择10个菌株（QC和/或临床菌株）， 每天重复检测3次，连续3天。

部分验证：1日内重复检测QC菌株（至少革兰阳性菌和革兰阴性菌各一株）， 3次。

8.2.3.2.2  可接受标准

严格按照制造商使用说明的要求进行结果判读，符合率以最终仪器报告的鉴定结果来评估。菌株鉴 定结果符合率应为100％。

8.3  血清学鉴定

8.3.1  验证时机

验证时机见本标准第5.1条通用要求。

8.3.2  验证菌株

血清学鉴定试验包括沙门菌属、志贺菌属等的血清学分型。沙门菌属至少包括伤寒沙门菌、甲型副 伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌；志贺菌属包括福氏志贺菌、宋内志贺菌、痢疾志 贺菌和鲍氏志贺菌四种；致病大肠杆菌/弧菌等根据当地卫生行政管理和实验室情况进行选择。

优先选择标准菌株和QC菌株，也可使用实验室确认过的留样临床菌株。本地区常见血清型菌株每种 至少1株。

8.3.3  验证方案

严格参照实验室操作规程和生物安全要求进行操作（参见GB 19489和WS/T 442）。每次实验以生理 盐水作为菌株自凝集对照。

8.3.4  可接受标准

要求准确度100％。

9.1  验证时机

实验室引入经药监部门批准的、未经修改的商品化检测系统时，使用前应进行全面验证。比较新系 统与现有系统的全面验证方案示例见附录C表C.1。

实验室使用中的检测系统，对试剂、数据库、分析软件和硬件等进行升级后， 增加药物稀释浓度以 覆盖药物新折点时， 应进行部分验证，详见表5。

9.2  验证菌株

9.2.1  菌株的种类

性能验证用菌株应适用于待验证系统且兼顾药敏板的类型、每种药物的抗菌谱、检测的范围。产品 说明书中未列出的菌种不列入验证范围。所选敏感和耐药菌株的数量宜均衡；优先使用非冻存的、新鲜 的临床菌株；菌株数不够时， 也可使用冻存菌株、室间质评或其他来源的菌株。检测前，冻存菌株传代 2次， 且传代后 24 h内使用。

临床菌株包括但不限于以下菌株：

a)  革兰阳性菌：不同药敏谱型的 MRSA、MSSA、凝固酶阴性的葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌各 2 株。

b)  革兰阴性菌：①含 ESBL 在内的不同药敏表型谱的大肠埃希菌 5～10 株；②含 ESBL 在内的不 同药敏表型谱的肺炎克雷伯菌 3～5 株；③不同药敏表型谱的阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌、弗

劳地枸橼酸杆菌、黏质沙雷菌、摩根摩根菌和普罗威登菌属各 1 株；④不同药敏表型谱的铜绿 假单胞菌 4 株；⑤奇异变形杆菌 1 株。

注：MRSA，methicillin-resistant Staphylococcus aureus，苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌；MSSA，methicillin- susceptible Staphylococcus aureus，苯唑西林敏感的金黄色葡萄球菌；ESBL，extended-spectrum  β- lactamase，超广谱β内酰胺酶。

QC 菌株包括但不限于以下菌株：金黄色葡萄球菌 ATCC 29213、粪肠球菌 ATCC 29212、粪肠球菌 ATCC 51299、金黄色葡萄球菌 ATCC 43300、金黄色葡萄球菌 ATCC BAA-977、大肠埃希菌 ATCC 25922、大肠 埃希菌 ATCC 35218、铜绿假单胞菌 ATCC 27853 和肺炎克雷伯菌 ATCC 700603。

9.2.2  菌株的数量

每种药敏板至少测试30株菌。应尽可能选择临床菌株， 包括特殊或少见耐药表型菌株，所选QC菌株 的数量不应超过菌株数量的50％。

9.3  验证方案

9.3.1  比对方法的选择

包括参考方法（如微量肉汤稀释法）和其他已验证过的商品化方法。若实验室目前无药敏检测系统， 可在新系统上使用已知药敏结果的冻存菌株进行验证；或与通过权威机构认可的实验室联系，将检测结 果与该实验室验证过的药敏系统进行比对。

9.3.2  准确度、精密度（再现性）验证过程和可接受标准

准确度（CA和EA）和精密度（再现性）验证过程和可接受标准详见表5和附录B表B.1。

9.3.3  药敏试验的数据分析和矛盾结果的解决

分析药敏检测系统的结果至少包括CA。如果检测的倍比稀释度有限（如2～3个），不需评估EA；如 果倍比稀释度大于4个， 且报告的MIC值可用于指导治疗时， 评估EA。分类错误或MIC值差异超过一个倍 比稀释度时，保存菌株并补充可能的附加试验。

实验室应重新检测具有主要分类偏差或分类错误的菌株。最好使用相同的接种物同时在两个系统 上检测，并重复三次。如重复试验结果仍不一致， 使用第三种方法，优选参考方法。