在临床医疗实践中，当运用宏基因组二代测序（mNGS）检测感染病原体时，经常会看到报告展示检测到的病原体序列数非常少（低序列数），这些病原体到底有没有致病意义？下面我们一起来学习来自南京大学医学院附属金陵医院施毅教授的关于如何正确解读 mNGS 低序列病原体报告的经验分享。 许多临床医生拿到一份 mNGS 报告时，往往只对其中的两个指标感兴趣：检测到的病原体和其数量（reads），这是远远不够的，要理解这一点，必须从技术和临床两个角度综合进行评估，才能正确地解读一份 mNGS 报告。
mNGS 技术分为湿实验和干实验，整体流程大致分为 7 个步骤：样本采集、样本前处理、核酸提取、文库构建、上机测序、生信分析和报告解读（见图 1）。
图 1. mNGS 实验流程
① 标本不同，处理不同：血标本通常不做破壁处理，直接提取病原体 DNA，血液标本中人源背景的 DNA 过多，破壁会影响结果；
② 要求不同，检测不同：常规 mNGS 检测通常仅检测 DNA 病原体，呼吸道感染的病毒多为 RNA 病毒，需要另外一份标本专门检测病毒 RNA；
③ 感染不同，标本不同：不同部位感染，要求采集的标本不同；应尽量采集接近感染部位的标本，如呼吸道感染时最佳标本为 BALF；
④ 抗菌与否，敏感不同：mNGS 的敏感性非常高，应用抗菌药物对检测结果的影响虽然没有培养那么明显，但仍然建议应尽量在应用抗菌药物之前采集标本，以增加检测的敏感性。
（二）如何在众多原始数据中给出临床真正需要的病原体信息？
一份 mNGS 检测报告，如果显示查到 4 种病原体，但实际上基因检测公司检测出的微生物至少在 500 种以上，多的时候可检出 1000 多种。那为什么检测报告只显示 4 种？其实在出具报告的时候是遵循了一些原则的，具体如下：
① 对病原体分类，建立多种数据库：对于任何一份临床标本，需要关注其中的三个成分：1. 疑似病原体、严格致病或条件致病病原体；2. 人体微生态菌群（人体正常存在微生物）；3. 试剂工程菌（实验过程中试剂设备引入的微生物）。
② 技术解读大致流程（见图 2）：分为三个流程，首先把检测到的微生物与试剂工程菌数据库进行对比，如果是试剂工程菌就放入原始数据库中；
再与微生态菌群数据库进行对比，如果是微生态菌群就排除掉，或不能排除感染，就进入下一步分析；
最后剩下的是疑似致病菌，根据病原体的分类，最后挑选序列数多的排在前列的报告给临床；
当然，确定致病的病原体，哪怕序列数很少，也报告给临床：疑似致病菌。
值得注意的是，这种人为报告的操作过程，就有可能会出错。
图 2. 技术解读大致流程致病病原体：不能遗漏，检出即报（如军团菌、鹦鹉热）；
mNGS 技术虽然解决了临床病原学检测的一大难题，但任然存在许多问题，需要不断发展，其及时正在走向规范化与全流程自动化。目前常见的除普通 mNGS 技术之外，新的改进的技术类型不断涌现：
（一）定量 mNGS（Q-mNGS）：定制分子内标，实现标本中人源和病原的相对定量检测，区分真假阴性和病程监控。
mNGS 可以解决目前临床疑难危重症感染病原学的诊断需求，但仍面临诸多挑战，tNGS 是通过超多重 PCR 或基因探针捕获的方式对病原体进行正向富集后，再结合 NGS 进行比对，检测样本中的病原微生物和耐药基因信息，以提高检测的敏感性和准确性。
tNGS 是用正向扩增的方法，扩增出临床上常见病原体基因序列，增强检测灵敏度，但是可能漏掉一些病原体，可用两种方法实现 tNGS，第一种是多重 PCR 扩增，第二种是探针杂交捕获，这两种方法各有优缺点。探针捕获 tNGS 和多重 PCR 扩增 tNGS 的对比，见图 3。
图 3. 多重 tNGS 与捕获 tNGS 的区别tNGS 可以设计为不同场景的检测方案，分别应用于上呼吸道感染、下呼吸道感染（CAP，HAP）、中枢神经系统感染、消化系统感染、结核病、真菌感染，以及大综合方案等。因为相对经济，检测时程缩短，准确敏感，临床的接受程度大大提高，越来越多的公司开发了各种 tNGA 的检查技术。但是，依然需要去关注如何正确的解读靶向扩增后的结果。
应用 mNGS 检测血液标本仅仅检测血浆中的游离 DNA，因为离心沉淀的血细胞层含有太多的背景 DNA。需要对血液标本的检查方法进行改进，以提高检测的敏感性，因为血液标本的优点是采集方便，特别有利于动态观察病原微生物的变化。血液感染的分子检测现状见图 4。
图 4. 血液感染分子检测现状传统的血液标本检测技术是分离血浆，不破壁，仅仅检测血浆中的游离 DNA（fDNA）, 现有多种改进方法，改进方法 1：血液不离心，整体标本直接破壁，再行测序，以保证不易破壁和细胞内病原体的检出；改进方法 2：血液离心，分别做血浆和细胞层的 mNGS 检测，其中细胞层行破壁处理后进行检测。两种方法都可以提高检测的敏感性，但整体血液标本不离心检测亦可能损耗部分病原体而降低某些病原体的检出率。
根据微生物在下呼吸道的致病性特征，初步分为致病性微生物、条件致病微生物和疑似背景微生物引起感染。条件致病微生物的判断，需要结合患者的宿主因素、血液理化指标和影像学特征、抗感染药物用药史及治疗反应、传统微生物学检测结果综合分析。
高等级致病性病原体：如结核分枝杆菌、新生隐球菌、鹦鹉热衣原体等，在大部分类型样本中均可能是病原体；
中等级的条件致病菌：如念珠菌属，在外周血、脑脊液、穿刺液等无菌体液样本中可能是病原体，但在痰液、肺泡灌洗液、尿液中可能是共生菌，需结合临床特征慎重判断致病可能性；低等级的条件致病菌：如凝固酶阴性葡萄球菌，在外周血、痰液、肺泡灌洗液、尿液等大部分样本类型中可能是共生菌，只在少数情况下如侵入操作后的脑脊液/外周血样本、感染性心内膜炎的赘生物样本中可能致病；
疑似背景微生物引起感染：在某些感染样本类型中能与低等级的条件致病菌相互转化。因 mNGS 技术检测感染性病原体为定性检测，不能区分是否为优势菌，故对于某些开放性样本的诊断价值应持慎重态度。
（一）低序列数病原体定义：低序列数没有一个确切的标准，对于那些难以破壁或寄生于细胞内的病原体（如分枝杆菌属、诺卡菌属、曲霉属、毛霉目、隐球菌属与双相真菌等），一般 1~3 条即定义为低序列检出；对于常见病原体特别是医院获得性感染常见条件致病菌（如鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等），即使检测出 10~20 条也可以考虑为低序列检出。我们强调的不是到底多少算是低序列数，而是在这种情形下如何判定的正确的诊疗思路。
（二）低序列数出现原因：
1. 标本中病原微生物的载量本身较低：① 疾病本身原因导至病原体载量较低；②采样技术导至的病原体载量较低；③不同标本病原体的含量不一。
2. mNGS 技术本身导至的低序列数（技术本身难以避免的问题）：① 难以检出的病原体（核酸提取难度大）；② 宿主细胞基因含量的影响；③ 不同测序平台的影响；④ 数据库的完整性和准确性。
3. mNGS 检测结果报告流程本身导至的低序列数。
（三）如何验证低序列数检测结果可靠性
1. 应用 PCR 或其他特异性检测方法验证：当临床难以确定 mNGS 检出的低序列数微生物的意义，又无法用临床微生物常规实验室方法验证时，可采用 PCR 检测加以验证； 2. 同时检测两份不同来源的标本：如同时取样呼吸道标本和非呼吸道标本；
3. 专项对比验证：如果检出的低序列数病原意义重大，可要求检测方提供该微生物对应的序列，直接与高质量的参考基因组比对；
4. 再次送检：当综合评估后，仍然难以确认检测出的低序列数病原的意义，临床也不能排除感染性疾病的可能性，必要时可以再次采集标本送检 mNGS，同时提示实验室检测时特别关注疑似的病原体。
（四）如何结合临床正确解读 mNGS 低序列病原体报告
1. 结合临床标本类型与检出病原体进行解读：临床标本需严格把握标本采集的无菌原则，从临床角度避免可能的污染。
2. 结合临床表现和感染标志物进行解读：包括感染性疾病的临床症状体征，常规实验室检查（血常规、血沉等）、影像学改变和生物标志物（C 反应蛋白、降钙素原等），判断是否存在感染的临床证据，没有临床感染证据的 mNGS 检查结果很可能为去宿主放大的背景菌，或是定植的病原体，判定为致病菌的可能性非常低；反之应进一步确认其致病的可能性。
3. 结合临床微生物常规实验室检查结果解读：结合微生物常规实验室检查，如下呼吸道标本的涂片、镜检，培养，病原体特殊染色，血清学如病原体的抗原和抗体检测；必要时组织病理学检查结果。
4. 综合评估与分析：mNGS 检出的病原序列数差异受众多因素影响，因此对于病原体临床意义的判断，应进行综合评估分析，建议由包括实验室技术人员、生信分析人员、临床主管医生、临床微生物专家、临床感染病专家组成的团队，结合患者的临床表现、影像学改变和其他实验室检测结果，共同商议决定；仍然难以确定时可以进行多学科（MDT）讨论。
mNGS 报告需要从两个角度来分析它，第一个从技术角度，第二个从临床角度。临床医生首先需了解 mNGS 的技术原理，才能做到正确解读。其次是一定要结合临床，综上所述，低序列数病原体的解读必须建立在对基因技术的深入了解、对患者病情的正确评估、对检测结果的综合解读上，才能去伪存真，直达真相。
插图：讲者 PPT
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