《自然》子刊：用于肿瘤检测中miRNA生物标志物开发新方向

逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）已成为检测miRNA的金标准工具。与长RNA物种（如mRNA）不同，短miRNA需要特殊的RT过程来结合有助于PCR扩增和检测的扩展序列。已经开发了许多等温分析来推进miRNA检测，包括滚环扩增（RCA），指数扩增反应（EXPAR），环介导的等温扩增（LAMP），杂交链反应和催化发夹组装。尽管这些测定具有简单甚至无需仪器操作的优点，但也存在限制广泛临床应用的缺点，例如EXPAR和LAMP的非特异性扩增和高背景信号，以及杂交链反应和催化发夹组装的相对较慢的动力学和低灵敏度。其他标准技术，如微阵列、NanoString和测序，需要复杂的仪器或具有复杂的分析工作流程、高操作成本和有限的分析性能，这阻碍了它们在临床诊断中的广泛应用。

近日，一组来自美国的研究团队在杂志Nature biomedical engineering上发表了一篇题为“A one-pot isothermal Cas12-based assay for the sensitive detection of microRNAs”的文章。在这篇文章中，研究团队报道了一种一步、一锅等温CRISPR-Cas12a检测方法（EXTRA-CRISPR），用于快速特异性检测miRNA，其灵敏度与RT-PCR相当。作者将EXTRA-CRISPR测定用于量化细胞外囊泡（EV）中的miRNA生物标志物（miR-21、miR-196a、miR-451a和miR-1246），用于基于液体活检的胰腺导管腺癌（PDAC）诊断，并通过对相同临床样本进行平行RT-qPCR分析，严格验证了EXTRA-CRSPR测试的分析和诊断性能。结果表明，该技术可能有助于推进miRNA检测和miRNA生物标记物的临床开发，以用于基于液体生物检测的癌症诊断和预后。

EXTRA-CRISPR检测被设计为三酶级联，利用CRISPR-Cas12a系统的核酸剪切活性（顺式切割和反式切割功能），将线性RCA转化为用于miRNA检测的指数扩增方法。简言之，Cas12a-RNP可以通过其顺式活性结合并切割RCA的长ssDNA扩增子，从而产生许多含有靶序列的二级引物来启动随后的RCA循环，从而导至靶的指数扩增。同时，扩增子激活的Cas12a RNP非特异性切割ssDNA报告子以产生和放大荧光信号。

作者优化了EXTRA-CRISPR测定法的padlock探针结构、连接酶、变性退火步骤、RCA相关缓冲液添加剂、聚合酶浓度、CRISPR组分如RNP和报告子浓度。优化后的EXTRA-CRISPR测定法的分析性能通过金标准RT-qPCR的平行测量得到了系统验证。与商业miRCURY LNA miRNA PCR试剂盒相比，EXTRA-CRISPR一锅法检测灵敏度相当，按照3小时实验流程其LOD为1.57 fM。

为了评估此方法的特异性，作者检测了许多非靶miRNA，包括一个在padlock-1连接位点具有单核苷酸错配的合成miR-21和8个1 pM的人miRNA。这些测试产生的信号水平约为miR-21信号的2%，甚至更低（如下图k），显示了优异特异性。对于从连接位点偏移三个核苷酸的单个错配，仍然可以获得相当好的特异性，非特异性信号水平约为25%。总的来说，结果验证了一锅EXTRA-CRISPR测定法，该测定法使用适当设计的padlock探针以个位数的飞摩尔敏感性和单碱基特异性快速检测miRNA。

作者采用了EXTRA-CRISPR测定法来检测用于诊断PDAC的小EV（sEV）miRNA，为此，使用细胞培养基和人血浆样品分离sEV并提取短RNA，然后使用一锅EXTRA-CRISPR和两步RT-PCR测定进行平行测量在PDAC中失调的miRNA包括miR-21，miR-196a，miR-451a和miR-1246。通过EXTRA-CRISPR检测三种miRNA的校准图，从中确定miR-196a LOD为1.35 fM（5–500 fM线性范围），miR-451a为4.14 fM（5–500 fM线性范围）和miR-1246为7.96 fM（20–500 fM线性范围）。这些LOD与标准RT-qPCR测定的LOD相当（下图c）。EXTRA-CRISPR测定也显示出对四个miRNA靶标的高度特异性检测，单个padlock探针和三个非靶标之间的交叉反应性最小（下图d）。总的来说，这些结果证实了EXTRA-CRISPR方法有优异的敏感和特异性。

接下来评估了EXTRA-CRISPR分析法，以测量无癌对照组（n = 15） 和PDAC患者（n = 20） 的血浆样本。使用EXTRA-CRISPR测量EV miRNA，同时量化miR-21、miR-196a、miR-451a和miR-1246的水平。如图e所示，每个受试者的四种血浆EV miRNA标记物的浓度，它们在PDAC队列中的表达升高，与之前的研究一致。与单个标记物相比，EV Sig（miR-21、miR-451a和miR-1246的加权线性组合）提高了区分PDAC组和健康组的能力。AUC值范围从miR-196a的0.677到miR-451a的0.793。EV-Sig小组极大地提高了诊断能力，AUC为0.853。

为了测试POC应用，作者试图建立一个低成本、便携式智能手机的EXTRA-CRISPR检测系统。这个原型是由3D打印的身体部件、蓝色LED管、光学滤波器和加热板组成（下图a）。将智能手机安装在设备上以获取荧光图像，然后对其进行分析以测量荧光强度。

作者首先评估了等温EXTRA-CRISPR反应的POC原型，并与商业qPCR热循环仪进行了比较。结果显示，当检测从四名对照供体和四名PDAC患者的血浆样本中分离的sEV中的标志物，POC设备能够检测三种sEV miRNA标记物的差异水平，并区分PDAC组与对照组，这与使用qPCR 等温测试的诊断结果一致。

EXTRA-CRISPR测试也可与侧流分析相结合（EXTRA-CRISPR-LFA）。下图i显示了使用EXTRA-CRISPR-LFA进行miRNA检测的结果，其显示了随着靶浓度增加，测试线的强度增加。与荧光检测模式相比，LFA检测显示定量分析性能下降，表现为校准图的线性下降，100 fM LOD和<2-log检测范围。尽管如此，EXTRA-CRISPR-LFA测试在miRNA检测方面大大优于现有的LOD在皮摩尔水平的LFA方法。

使用相同的患者样本测试智能手机设备，结果证明了EXTRA-CRISPR-LFA测试对sEV miRNA的无仪器临床分析的适用性。在这三种标记物中，sEV miR-451a的LFA检测产生了最高的视觉信号（下图j）和最佳的诊断性能（下图k）来检测PDAC样本。总的来说，对两种常用的POC检测模式的原理验证研究表明，EXTRA-CRISPR技术有潜力成为开发新的低成本POC诊断测试的适应性工具。

EXTRA-CRISPR具有灵敏和特异的分析性能、易于操作、快速反应和低成本的特点，为临床样本中的miRNA分析提供了一种替代标准RT-qPCR的有竞争力的选择。该方法的简单性将极大地促进未来仪器或微流体的小型化和集成，以完全自动化工作流程，进一步提高分析吞吐量和再现性，并减少样品消耗和周转时间。

EXTRA-CRISPR检测与现有的基于CRISPR的生物传感方法有三个主要区别。首先，它同时利用了CRISPR–Cas12a系统的顺式切割和反式切割活性的策略。其次，通过设计模块化padlock探针设计和反应动力学，将靶介导的连接、RCA、Cas12a结合和核酸切割的多种反应整合到一起，创建了一步单管等温分析。第三，这种一锅等温miRNA检测提供了与标准RT-qPCR相当的分析性能，包括具有飞摩尔检测极限的高灵敏度、单核苷酸特异性和快速灵活的周转。最后，一锅EXTRA-CRISPR技术极大地简化了分析工作流程，消除了对专用仪器的需求，为POC诊断提供了一种适应性强的模式。