《Nature Biotech》:新工具可预测基因编辑的成功率

自2012年CRISPR-Cas9技术问世以来，基因编辑便驶入了快车道，取得了一系列新突破。如果将CRISPR-Cas9比作能够破坏目标基因的分子剪刀，那么base editor（碱基编辑器）可以称为分子铅笔，因其能对单个核苷酸进行替换。2019年开发的prime editor则具有更强大的功能，能够对基因组进行搜索和替换，堪称分子世界的“文字处理器”。

开发这些技术的最终目标是修复人类基因中的有害突变。16,000多个小的缺失变异与人类疾病存在因果关系，理论上可以通过插入缺失的序列来修复。囊性纤维化就是一个很好的例子，70%的病例由三核苷酸缺失而引起。

为了实现临床应用，人们需要一种技术来准确、高效且安全地插入序列，避免出现意外的结果。prime editing系统虽然在治疗囊性纤维化等遗传病上表现出巨大潜力，但目前仍不清楚哪些因素决定了编辑效率。

英国Wellcome Sanger研究院和爱沙尼亚塔尔图大学的研究人员近日在《Nature Biotechnology》杂志上发文称，他们开发出一种新工具，可预测将基因编辑的DNA序列成功插入基因组的几率¹。

在这项研究中，研究人员试图系统评估插入序列的长度和组成、细胞系、目标位点以及prime editor的不同版本如何影响插入效率。

为此，他们共设计了3,604条pegRNA，编码切口位点上游的插入物，这些插入物的长度从1 nt到69 nt不等，且GC含量不同。他们将序列插入两个细胞系（HEK293T和HAP1细胞）中，靶向四个目标位点（HEK3、EMX1、FANCF和CLYBL）。一周后，他们对这些细胞进行基因组测序，观察编辑是否成功。评估插入效率的整体策略详见图1。

图1. prime插入效率的高通量测定

由于插入率的变化跨越了三个数量级，于是研究人员试图了解相关的特征，首先是插入物的长度。他们在HEK293T细胞中发现了两个特点：3和4 nt序列的插入率高于其他序列；15-21 nt序列的插入率高于周围的序列。不过在HAP1细胞中，1-4 nt短序列的插入率并没有高于较长序列。他们将其归因于错配修复（MMR）系统，因为HEK293T细胞在MMR上存在部分缺陷。敲除错配修复基因MLH1的HAP1细胞也证明了这一点，表明MMR系统阻碍了短序列的插入。

之后，他们分析了prime editing的不同步骤如何影响序列的插入率。他们发现，若pegRNA中带有四个或更多的连续腺嘌呤，则插入率会大大下降。此外，prime editing中的另一个重要步骤是带有5’ flap（包含野生型序列）和3’ flap（包含插入物）的中间产物之间达到平衡，而5’ flap核酸酶FEN1及3’ flap核酸酶TREX1和TREX2介导了这种平衡。他们发现，3’ flap核酸酶TREX1和TREX2抑制了较长序列的插入。

同时，插入序列的核苷酸组成和二级结构也会影响插入率。研究人员发现，prime editing系统对胞嘧啶有着明显的偏好。插入序列中每增加1%的胞嘧啶，则插入率平均增加2.2%。相反，腺嘌呤和胸腺嘧啶的百分比则降低了各个位点的插入率。此外，他们还发现，结构强度更高的序列能够被更有效地插入。

在此过程中，他们使用了Twist Bioscience提供的寡核苷酸池。据Twist介绍，他们独特的硅基DNA合成平台能够在单次运行中生成超过一百万条寡核苷酸，对数量几乎没有限制，而且寡核苷酸池精准均一，让人们对实验结果充满信心。此外，实验中使用的多个载体和基因片段也是由Twist Bioscience提供的。

在了解影响插入率的多个因素后，研究人员接下来想预测不同序列在同一位点的插入效率。他们采用了机器学习的方法，挑选出10个特征来训练数据，包括插入序列的长度、组成、pegRNA二级结构和MMR等。这种称为MinsePIE的方法能够很好地预测测试数据的插入效率，相关性达到0.68（图2）。

在现有数据上进行训练后，他们在新数据上测试MinsePIE模型，发现它能够准确预测多个插入序列的成功率。之后，他们还对预测的序列进行实验测试。与预测插入率较低的变体相比，预测插入率较高的密码子变体确实表现出较高的插入率，这凸显了MinsePIE模型在密码子优化方面的优势。研究人员认为，这种计算模型可以帮助人们选择出最有效的序列写入基因组中。

图2. 预测prime插入效率

最后，对于如何提高prime editing系统的插入效率，研究人员提出了几点建议。他们建议选择胞嘧啶含量高且容易形成二级结构的序列。对于使用U6启动子的pegRNA，尽量避免腺嘌呤的插入。对于小于14 nt的序列，暂时抑制MMR或敲除MLH1将极大提高插入效率。总的来说，这项工作增加了人们对短序列插入效率的理解，有望实现复杂的基因组工程和纠正各种致病突变。

参考文献

1. Koeppel, J., Weller, J., Peets, E.M. et al. Prediction of prime editing insertion efficiencies using sequence features and DNA repair determinants. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01678-y