我们人类居住的地球,同时也生活着千千万万其它生物(动物、植物、细菌、真菌、病毒等)。生命的外形千变万化,那是什么造成这种多样性的存在呢?如果大自然真有一个设计者,那么极具智慧的他/她/它?选用核酸作为最根本的物质来编写生命之书。列文虎克发明人类第一台显微镜并最早看到了构成生命基本单元的 “细胞”。自此,人们通过对细胞的深入研究认识到地球上的所有生命是由核酸、蛋白、糖和脂类这些有机物组成的。龙生龙,凤生凤,这是一种遗传现象。地球生命外在不同的根本原因是其遗传物质的不同。现在,我们都知道核酸是一切生命的遗传物质,它编码蛋白,蛋白行使各种生命功能。但在历史上,科学家们为谁是生命遗传物质的载体—核酸还是蛋白,争论了几十年。核酸的基本组成单位很简单(A、G、C、T四种核苷酸),而且是线性排列的,我们和蚂蚁细菌等的不同的根本原因是各自含有的染色体AGCT长度不同,排列顺序不同。反之,蛋白质复杂得多,有20几种氨基酸组成,而且有一级、二级、三级、四级结构,不同结构有不同活性。可是我们的大自然母亲(mother nature,个人很喜欢这个词)偏偏选用了简单的4个基本零件来构建地球上无数复杂生物的遗传物质。 回到我们人类的健康问题,很多疾病最根本的原因是编码某种功能蛋白的基因(核酸)出问题了,比如遗传病、肿瘤等。那我们就要用放大镜(人类现有的研究生物分子的工具),去寻找这些基因哪里出问题了,这些患者的基因哪里和正常人不一样?这些手段,在医学上就是分子诊断技术,又被称为分子病理,它通过分子生物学方法研究人体组织或液体标本中特定遗传物质及其编码产物表达水平的变化而做出疾病诊断。广义上研究核酸和蛋白,但在在狭义上,通常指大众所熟知的基因检测,即通过对核酸(DNA或RNA)的检测来实现疾病诊断。检测的对象包括人类自身的核酸(内在的)和病原体的核酸(外来的)。分子诊断可以实现高度准确和敏感的诊断检测,彻底改变了医学领域(图1)。
图1. 分子诊断应用领域
在临床上,分子诊断的用途包括: 1.诊断:识别导至疾病的病原体或基因突变的存在。 2.预后:评估疾病的严重程度并预测其进展。 3.治疗监测:监测治疗的有效性并确定何时需要更改治疗方法。 4.筛查:识别在症状出现之前有患病风险的个体。 5.监测:监测人群中疾病的传播情况。
分子诊断使用多种技术,目前医学实验室里最常用的技术包括: 1.聚合酶链式反应(PCR):一种将DNA或RNA扩增以检测特定遗传物质序列的技术。 2.下一代测序(NGS):一种高通量测序技术,可以快速测序大量遗传物质,从而可以同时识别多个病原体或基因突变。 3.微阵列:一种允许同时检测多个病原体或基因突变的技术。 4.荧光原位杂交(FISH):一种使用荧光探针检测细胞中特定基因序列的技术。
实验室医学与分子遗传学的知识和技术相结合,诞生了分子诊断,分子生物学领域的重要发现是其最大的驱动力(表1)。
表 1. 分子生物学重要事件和分子诊断技术发展时间表 时间 | 事件 |
| 1949 | Categorization of sickle cell anemia as a molecular disease | 镰状细胞性贫血作为一种分子疾病的分类 | 1953 诺贝尔奖 | Discovery of the DNA double helix | DNA双螺旋结构的发现 | 1956 诺贝尔奖
| Isolation of DNA Polymerases by Arthur Kornberg | Arthur Kornberg 分离 DNA 聚合酶 | 1960 | Initial hybridization methods and electrochemical DNA Detection by Roy Britten | Roy Britten 的初始杂交方法和电化学 DNA 检测 | 1965 | Solid-phase oligodeoxynucleotide synthesis and Enzymatic synthesis of short RNAs | 短RNA的固相寡脱氧核苷酸合成和酶促合成 | 1969 | Development of In situ hybridization technique by Gall and Pardue | Gall和Pardue建立原位杂交技术 | 1970 诺贝尔奖 | Isolation the first restriction enzyme and reverse transcriptase by Hamilton Smith | Hamilton Smith 分离出第一个限制性内切酶和逆转录酶 | 1970 | Development of Nucleic acid hybridization methods | 核酸杂交方法的建立 | 1975 | Development of Southern blotting Technique | Southern印迹技术的建立 | 1977 诺贝尔奖 | Development of First Generation Sequencing technique-Sanger sequencing | 第一代测序技术—Sanger测序的建立 | 1980 诺贝尔奖 | Maxim Gilbert Sequencing method | Maxim Gilbert 测序法 | 1983 | First synthesis of oligonucleotides | 寡核苷酸的首次合成 | 1983 诺贝尔奖 | Invention of the polymerase chain reaction (PCR) by Kary Mullis | Kary Mullis发明聚合酶链式反应 | 1985 | Establishment of Restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) | 限制性片段长度多态性分析(RFLP)的建立 | 1985 | Development of technique for detecting patient’s beta-globin gene for the diagnosis of sickle cell anemia | 用于诊断镰状细胞性贫血的患者β-珠蛋白基因检测技术的建立 | 1986 | Development of Fluorescence in situ hybridization (FISH) | 荧光原位杂交(FISH)的建立 | 1988 | Discovery of the first thermostable DNA polymerase – Optimization of PCR | 发现第一个耐热 DNA 聚合酶– PCR 优化 | 1988–1991 | Invention of first DNA Chip conceptions | 第一个 DNA 芯片概念的发明 | 1991 | Designing of DNA/RNA mimics: peptide nucleic acid probes/PNA openers Ligase chain reaction; thermophilic DNA ligases | DNA/RNA 模拟物的设计:肽核酸探针/PNA 开启剂 连接酶链反应;嗜热DNA连接酶 | 1992 | Conception of real time PCR | 实时PCR的概念提出 | 1992 | Assays for whole genome amplification and Strand-displacement amplification | 全基因组扩增和链置换扩增 | 1992 | Development of Comparative genomic hybridization (CGH) | 比较基因组杂交(CGH)的建立 | 1993 | Discovery of structure-specific endonucleases for invasive cleavage assays | 发现用于侵入性剪切分析的结构特异性核酸内切酶 | 1992– 1993 | Branched DNA (oligonucleotide dendrimers). | 支链 DNA(寡核苷酸树枝状聚合物)技术建立 | 1994 | DNA topological labeling (padlock probes) | DNA 拓扑标记(挂锁探针) | 1995 | Innovation of rolling amplification of circular probes | 圆形探针滚环扩增的创新 | 1996 | Molecular beacon probes | 分子信标探针 | 1996 | First application of DNA microarrays | DNA微阵列的首次应用 | 1996 | Pyrosequencing technique-The next generation sequencing | 焦磷酸测序技术—下一代测序 | 1998 | Lab-on-a-ChiP(microfluidics) for DNA analysis | 用于 DNA 分析的芯片实验室(微流体) | 1985–1999 酶免获诺贝尔奖
| Development of Immunoassays (Elisa, Western Blot, Immunostaining) | 免疫测定法的开发(酶联免疫吸附试验、Western Blot、免疫染色) | 2000 | Development of Massively parallel sequencing (MPS) by Lynx Therapeutics | Lynx Therapeutics 开发大规模并行测序 (MPS) | 2001 | First draft versions of the human genome sequence | 人类基因组草图 | 2001 | Application of protein profiling assays in diagnosis of human diseases | 蛋白质谱分析在人类疾病诊断中的应用 | 2002 | HapMap project | HapMap项目 | 2002 | Development of Ion semiconductor sequencing | 离子半导体测序的建立 | 2005 | Invention of Single molecule real time sequencing by Pacific Biosciences (SMRT) | 单分子实时测序(Pacific Biosciences) | 2005 | Invention of 454 Pyrosequencer system | 发明454焦磷酸测序系统 | 2005 | Invention of Polony sequencing by George M. Church | George M. Church 发明 Polony 测序 | 2005 | Development of qRT-PCR, Virus microarrays | qRT-PCR、病毒微阵列的开发 | 2006 | Invention of Illumina/Solexa | Illumina/Solexa系统的发明 | 2007 | Invention of ABI/SoLID sequencing | ABI/SoLID测序的发明 | 1997-2011 | Lo YMD. discovery of cell-free fetal DNA in maternal blood and development of noninvasive prenatal testing | 卢煜明发现母体外周血中胎儿游离DNA并建立无创产前检测(NIPT)技术 | 2012 诺贝尔奖 | Discovery of CRISPR system; | 阐明CRISPR系统机制 | 2014 | Development of Portable oxford nanopore sequencing device | 便携式牛津纳米孔测序仪的研制 | 2016-2017 | CRISPR-Based Diagnostics—SHERLOCK and DETECTR | 基于CRISPR的诊断—SHERLOCK&DETECTR |
DNA双螺旋结构的解析是20世纪最重大的科学发现之一,自此人类开启了分子生物学时代。想想23岁的你在做什么?翘课?打网游?考研?找工作?23岁的沃森拿了诺贝尔奖。1951年,21岁的美国博士生沃森(在分子结构上可以说是0基础)跑到欧洲剑桥,找上志同道合的好基友克里克(35岁,物理学家,数学好),准备与大名鼎鼎的Pauling等人竞争,解决当时最热的科学难题—DNA结构。2年后,他们成功了,论文发表在Nature上,就一页纸,后来的事大家都知道。DNA结构的解析背后的八卦故事很精彩,详见《创世纪的第八天》。沃森是个聪明人,野心勃勃,会利用所有资源(包括人)实现目标。仔细探究他成功的轨迹,能给我们很多启示。不做实验能拿诺贝尔奖吗?可以的,沃森就是看了别人的DNA分子的X-射线衍射图,最后才推导出正确结构。虽然沃森主导了这一重要发现,但在整个事件过程中,在那个女性还倍受歧视的时代,一位女性学者Rosalind Franklin的贡献被忽视了,就是她拍到了非常关键的DNA结构图。沃森后来执掌冷泉港实验室几十年,但也再无重大发现,老了还晚节不保,因为歧视言论被罢免主任之职。克里克比较实在,后续又参与密码子破译,后来转投神经学研究。Rosalind在沃森他们拿奖那年逝世,即使活着也未必能拿到,她的上司威尔金斯拿了奖。
图2. James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins, Rosalind Franklin
在分子诊断发展过程有两座里程碑:一是测序技术;二是PCR,一种放大扩增特定DNA片段的分子生物技术。
第一代测序技术,又叫桑格(Sanger)测序,现在还在应用,是由我们的非常可爱的Sanger老爷爷发明的。Sanger老爷爷据说是个富二代,低调内敛,不像一般的纨绔子弟,他生平最大爱好就是做安安静静的做实验,一做就是五十年,包括拿了2次诺贝尔奖后还是默默的做他的实验。当年为了在剑桥做实验,他说不要钱给导师白干,导师很高兴,给他安排到地下室,跟别人共用一个实验室,那个人就在地下室养小白鼠,Sanger的工作台紧挨着鼠笼,养过小鼠的人就知道有多臭。Sanger并不在意这些。1958年,因成功测定了蛋白质的分子结构和氨基酸序列,他获得了首个诺贝尔化学奖;1980年,Sanger又因为发明了快速测定DNA序列的“双脱氧链终止法”,第二次获得诺贝尔化学奖。蛋白质和DNA,一个是生命活动的组织者和参与者,一个是生命“天书”,Sanger一个人就揭开了这两个最重要的生命分子的面纱。2013年,在他的乡下小花园,Sanger老爷爷在睡梦中离世,享年95岁。Sanger老爷爷成功的秘诀就四个字—埋头苦干,桑格的实验记录本上,出现最多的结论是“这个方案就是浪费时间……得从头再来”。当然,目前在分子诊断领域大显身手的是二代测序技术,在此不表。
图3. 1993年的Sanger
讲到分子诊断,PCR是一个绕不过去的技术,可以说PCR技术奠定了现今分子诊断技术的基础。几乎所有分子诊断技术,最重要的一步就是将原始样本中有限的DNA通过PCR放大到可以检测到的数量级。1983年Kary Mullis在Cetus公司工作期间发明了PCR技术。Kary也是个聪明人,大学期间就用个意外的idea发了篇Nature文章,但是他又懒惰,不喜欢动手。据说此君在男女关系问题上颇为同事所鄙视。PCR想法的产生也很有意思。据说,那天夜里,他磕了药,带着新欢,开着车,欢快地驾驶在高速公路上去度假。当时他的工作是提高寡核苷酸合成的效率,所以PCR想法也不是突然冒出来的。一条双车道的路(延绵的DNA双链),自己的车和对面开过来的车从远处渐渐接近(两条引物延伸),这个过程不断反复(PCR循环)(这是我瞎想的),bingo! 有了!这么简单的DNA合成的方法竟然没人想到!可是Kary太懒了,这个价值诺贝尔大奖的想法过了几个月他才在公司提出来。幸好公司识货,给他配了3个人研发这个技术,其中就有一个非常关键的勤劳的日本人Saiki。PCR从原理到技术实现也颇费周折,日本人找到了重要的耐热聚合酶。PCR这事有很多八卦,要提一下的是,公司让Mullis写原理的paper,Saiki写应用的paper,1985年Saiki为一作的第一篇PCR paper发表在Science(诊断镰状细胞性贫血的患者β-珠蛋白基因检测技术),而彼时我们的贪玩Boy—Mullis才写完他自己的那篇文章!他四处投稿被拒,最后在一年后才发表在一个不知名的杂志Methods of Enzymology。幸好,诺贝尔奖还是给他,从此更加肆意放任自己的人生(好生羡慕),再也没做出任何发现/发明。
图4. 两车对开 vs PCR?
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