《nature子刊》！合成生物标志物用于非侵入性癌症检测

分析化学中有很多用于多路复用的分子策略，包括DNA条形码转化药物筛选、基因表达谱分析和细胞功能分析。然而，体内核酸的敏感性阻碍了合成生物标志物DNA的多路复用。当不受核小体保护时，DNA会被降解。具有化学修饰的治疗性核酸可以抵抗系统降解，但不能用传统聚合酶扩增，也不能方便检测，从而阻止其用于诊断平台。

近日，一组来自美国的研究团队在杂志Nature nanotechnology上发表了一篇题为“CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics”的文章。文章中，为了将合成生物标志物用于护理点（PoC）精准诊断，作者利用化学稳定的DNA进行分子条形码，并依赖于微环境内肽酶来触发尿液中核酸条形码的释放和无聚合酶扩增的CRISPR-Cas介导的条形码检测。结果表明，DNA编码的纳米传感器可以在移植和原位小鼠癌症模型中无创检测和区分疾病状态。作者利用这项技术设计了一组高通量、可编程的体内纳米传感器，用于尿液中的非侵入性疾病检测和监测。

DNA编码的合成尿液生物标志物（DNA SUBs）（1）靶向体内病变部位，（2）感知肿瘤微环境中失调的蛋白水解，和（3）释放在循环系统中存活并被肾脏浓缩的核酸条形码，（4）通过与引导RNA的序列互补性激活CRISPR-Cas12a的单链DNA酶活性。通过病理性蛋白水解活性释放，使用荧光动力学在尿液中检测到化学稳定的DNA条形码，或在Cas12a激活后在试纸上检测到。DNA条形码的大规模多重性为对复杂的人类疾病进行分类打开了大门。为了证明其模块性，作者在纳米体或合成聚合物支架上组装了DNA SUB，并在小鼠模型中对三种不同类型的原发性和转移性癌症进行了无创检测和监测。

研究团队尝试使用硫代磷酸修饰的DNA激活Cas效应蛋白CRISPR-Cas12a。这些DNA在CRISPR RNA（crRNA）结合时释放Cas12a的旁切切割活性，导至荧光报告子DNA的反式切割。实验证明，来自注射了硫代磷酸化ssDNA的动物的尿液保留了触发LbaCas12a的旁切核酸酶活性的能力。使用侧流纸带上的比色读数也可以检测到未处理尿液中的修饰DNA分子（图c）。前部“样品带”的存在表明，在LbaCas12a被尿液DNA激活后，可检测的FAM已通过报告子切割释放（图d）

作者利用肿瘤微环境中失调的蛋白水解活性来切割和释放化学稳定的DNA条形码，这些条形码集中在尿液中，以产生目标疾病的非侵入性读数。将一段肽底物序列标记具有组织亲和力的纳米体。肽底物对PCa相关蛋白酶PLAU（或uPA）有特异性反应。将PLAU可激活的纳米体与20-mer DNA条形码共价连接，纳米体（cMET-Nb-DNA）表现出增强的肿瘤积聚。

在人类前列腺癌症（PCa）异种移植模型中评估了合成生物标记物。与健康对照相比，cMET-Nb-DNA显著增加了从荷瘤小鼠收集的尿液样本激活的LbaCas12a的反式切割率（图d）。进一步可将荧光读数转化为PoC检测工具，可用测流层析使结果可视化（图e）。

异质性疾病的诊断敏感性和特异性可能需要分析多种癌症特征。研究团队构建了一个DNA-SUB的多路复用面板。每个DNA-SUB具有20聚体的硫代磷酸化DNA标记的蛋白酶激活肽（PAP），其共价偶联到八臂PEG纳米载体（图a）。

蛋白酶激活的肽（PAP7、PAP9、PAP11、PAP13、PAP15）在体外被肿瘤组织匀浆特异性切割，被用于DNA SUB面板（图c）。通过分析每个DNA条形码触发的反式切割活性，作者发现DNA-PAP7-SUB在肿瘤接种后第11天肿瘤结节为1-2 mm时成功区分了荷瘤小鼠和健康小鼠 。随着时间的推移，DNA-PAP9-SUB、DNA-PAP15-SUB传感器差异也被放大。基于ROC曲线分析，PAP7，PAP15和PAP9蛋白酶底物信号的总和显著增加了DNA SUB的分类能力。将此传感器面板与测流检测相结合，可实现视觉读数，且量化之后可表现出多个传感器的疾病分类能力。

作者假设，对疾病定位蛋白酶活性的多重测量可以对来源于不同来源组织的肿瘤进行分类。结果显示，在低等级疾病中（诱导7.5 周后），来自多重DNA-SUB面板的DNA-PAP9-SUB从健康小鼠中鉴定出携带肿瘤的小鼠。疾病进展时（诱导12 周后），除了DNA-PAP9-SUB外，DNA-PAP15-SUB蛋白酶切割趋势也变得显著，这反映在荧光和纸质条形码读数中，允许在ROC曲线分析中对患病与健康对照动物进行分类。

研究团队分析了尿液DNA条形码水平，评估了DNA SUB面板是否在疾病状态之间被差异切割。结果显示前列腺癌、原发性肺肿瘤和转移性CRC肿瘤中患病和健康小鼠报告基因浓度有差异，这显示了不同肿瘤类型之间蛋白酶活性的差异（图f）。不仅如此，作者实现了一个大规模复用的Fluidigm微流体平台（图g），评估了44个合成的20聚体ssDNA及其相应的crRNA，所有44个crRNA的中位AUC为0.99，允许在多孔分析中并行读出（图g）。

作者报道了一种合成生物标志物平台，该平台能够对微环境蛋白水解活性进行多重体内传感，通过DNA条形码中间体编码传感器，通过肾过滤浓缩，并实现基于CRISPR的扩增以在试纸上读出。该集成平台满足了理想生物标志物的几个特征：高信噪比、检测前循环稳定性、宿主生物流体易于获取以及疾病识别的高灵敏度和特异性。

酶的特殊底物识别和信号放大使DNA编码的SUB能够完全模块化，既有通过蛋白酶响应接头的可设计输入，也有通过CRISPR-Cas活性的可编程输出。除了全身注射外，合成生物标志物还可以重新配制用于口服、吸入和局部给药。未来的PoC诊断系统可能包含多路传感通道或表面结合点，并将受益于计算工具，以量化更复杂的传感结果并提高诊断准确性。通过这种方式，患者可以实现自我监测疾病进展的能力，从而实现早期发现和获得有效治疗。通过量身定制的应用程序，这些可编程传感器可以监测其他传染性和非传染性疾病，并指导治疗决策，以改善资源有限的环境中的疾病管理。