后基因组时代，研究的重点从基因组的结构转移到基因的功能，即从分子层面上探索生命的奥秘和多样性。本文分享一种不是“很新”的但实用的分子诊断技术---MLPA技术，它可以同时检测多个基因组靶区域的拷贝数变异和甲基化水平，从而诊断由基因组缺失/重复或由表观遗传异常所导至的遗传性疾病，如脊髓性肌萎缩症、假性肥大型肌营养不良、Prader-Willi/Angelman综合征等。具有成本较低、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，只需少量的DNA样本，就可以获得可靠的结果。还可以在产前诊断中发挥重要作用，通过对羊水或绒毛样本进行检测，可以及时发现胎儿是否存在染色体异常或其他遗传缺陷。 MLPA法是“多重连接依赖探针扩增的技术”的简称，是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的检测技术。它的基本原理是利用简单的探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。它可以同时检测多达50种核苷酸序列的拷贝数变化，并且可以检测小于60bp的片段。它可以用于检测一些与疾病相关的基因或染色体的缺失或扩增。 MLPA法的历史可以追溯到2002年，当时荷兰学者Dr.Schouten提出了这种多重连接依赖探针扩增的技术。他在一篇论文中描述了这种方法的原理和应用。MLPA法是由MRC-Holland公司开发和商业化的，该公司提供了各种MLPA试剂盒和分析软件。MLPA法自从提出以来，就受到了许多实验室的欢迎，因为它可以快速、灵敏、准确地检测基因的拷贝数变化和甲基化状态。MLPA法也被用于检测一些与疾病相关的基因或染色体的缺失或扩增，如遗传性乳腺癌、结肠癌、遗传性胃癌、神经母细胞瘤等。 MLPA主要用来检测DNA中的拷贝数变化（CNV）。DNA拷贝数变异（CNV）是指染色体上大于1 kb（有些文献认为大于50 bp） 的DNA片段的增加或者减少，主要表现为亚显微水平的缺失和重复。CNV是基因组结构变异（SV）的重要组成部分，是人类最常见（占人类基因组变异总量约10%） 的变异形式。CNV可以由基因组重排（如染色体缺失、重复、插入和易位）或非等位基因重组（如同源序列之间的错误配对和交换）导至。CNV可以影响基因的表达和功能，与许多遗传病和癌症相关。MLPA的原理是使用一对特异性探针来识别目标DNA序列，然后用连接酶将相邻的探针连接成一个可以被PCR扩增的分子。每对探针的长度是不同的，所以PCR产物可以通过电泳分离和荧光检测。通过比较样本和参照样本的峰值图案，可以计算出目标序列在样本DNA中的相对数量。MLPA可以用来检测与疾病相关的CNV，例如遗传性乳腺癌、结肠癌、杜氏肌营养不良等。MLPA也可以用来检测肿瘤中的CNV，以优化肿瘤分型。
01 实验步骤 •第一步：探针和靶序列DNA的杂交。将样品DNA与特异性探针混合，加入杂交缓冲液，置于恒温仪或水浴中进行杂交反应，使探针和靶序列DNA完全互补配对。 •第二步：探针的连接。将杂交反应体系转移到新的PCR管中，加入连接缓冲液和连接酶，置于恒温仪或水浴中进行连接反应，使相邻的探针连接成一个可以被PCR扩增的分子。 •第三步：探针的扩增。将连接反应体系转移到新的PCR管中，加入PCR缓冲液、dNTPs、通用引物和PCR酶，置于PCR仪器中进行扩增反应，使连接的探针分子被指数级扩增。 •第四步：扩增产物的电泳分析。将扩增反应体系与分子量内标和甲酰胺混合，置于毛细管电泳仪器中进行电泳分离和荧光检测，得到不同长度的探针分子的峰值图案。 •第五步：数据分析和结果解读。使用专业的软件对电泳数据进行峰值检测、归一化、质量控制和结果评估，判断样品DNA中是否存在拷贝数变化。 02 MLPA探针设计的原则
图源自premierbiosoft网站 •探针的长度应在40-70个核苷酸之间，最好在50-60个核苷酸之间。 •探针的Tm值应在55-65°C之间，最好在60°C左右，并且两条探针的Tm值应相差不超过5°C。 •探针的GC含量应在30-70%之间，最好在40-60%之间，并且两条探针的GC含量应相差不超过10%。 •探针的末端应避免出现G或C，以防止形成二级结构或非特异性杂交。 •探针应避免出现重复序列、同源序列或互补序列，以防止形成二级结构或非特异性杂交。 •探针应避免出现SNP位点，以防止影响杂交效率或特异性。 03 质量控制标准 •样品质量：样品DNA的质量和数量对MLPA反应的结果有很大影响，因此需要使用合适的DNA提取方法，避免DNA降解和污染，使用纯化的水或TE缓冲液稀释DNA，使用纳米光谱仪或荧光法测定DNA浓度。 •反应条件：反应条件的优化对MLPA反应的效率和特异性也很重要，因此需要按照试剂盒的说明书准确配制反应体系，避免引物二聚体和非特异性扩增，使用恒温仪或水浴进行杂交和连接反应，使用高保真（或者称为长片段） 的PCR酶进行扩增反应。 •电泳分析：电泳分析的质量控制主要包括荧光校准、分子量内标、峰值检测和归一化等步骤，需要使用与探针标记相匹配的荧光校准标准品进行光谱校准，以准确检测引物上的染料标记 ，需要使用与探针长度相匹配（通常是130-480 bp） 的分子量内标确定样品峰大小并校正进样误差（通常是ROX） ，需要使用专业（如Coffalyser） 的软件进行峰值检测和归一化，以消除不同样品间的变异。 •结果评估：结果评估的质量控制主要包括对参照样本、质控样本和检测样本的数据进行分析和解读，需要使用合适（如正常人） 的参照样本作为正常拷贝数的基准（通常是2） ，需要使用质控样本作为已知拷贝数变化（如1或3） 的对照（如人工合成或已知患者） ，需要使用专业（如Coffalyser） 的软件进行数据分析和结果解读（如计算拷贝数比例并设定阈值判断是否异常） ，以判断检测样本是否存在拷贝数变化。 04 数据分析流程 •第一步：峰值检测。对电泳数据进行峰值检测，得到每个样品每个探针的峰高或峰面积值。 •第二步：归一化。对每个样品的峰值值进行归一化（通常是除以内标峰值并乘以一个系数） ，消除不同样品间的变异（如进样量、PCR效率等） ，得到每个样品每个探针的归一化值。 •第三步：质量控制。对每个样品的质量进行评估（如计算CV值），检查是否有异常（如缺失、降低或增加）或低信噪比（SNR）等指标 ，排除不合格（如低于0.85或高于1.15） 的样品或探针。 •第四步：结果评估。对每个样品每个探针的归一化值进行比较（通常是除以参照样本平均值并乘以2），计算每个样品每个探针的拷贝数比例（ratio），判断是否存在拷贝数变化（如缺失、重复或正常）。 •第五步：结果解读。根据不同的检测目的和试剂盒，对每个样品每个探针的拷贝数比例进行解读，结合参照样本和质控样本的数据，得出最终的结论和报告（如是否存在某种微缺失综合征或其他遗传病） 。 05 临床和科研的应用案例 •遗传性乳腺癌和卵巢癌的检测。MLPA方法可以检测BRCA1和BRCA2基因的拷贝数变化，如缺失或重复，这些变化与遗传性乳腺癌和卵巢癌的发生有关 。 •遗传性结肠癌的检测。MLPA方法可以检测MSH2、MLH1、PMS2和MSH6基因的拷贝数变化，如缺失或重复，这些变化与遗传性非息肉性结肠癌（HNPCC）的发生有关 。 •神经母细胞瘤的检测。MLPA方法可以检测MYCN基因的拷贝数变化，如扩增或正常，这些变化与神经母细胞瘤的预后和分级有关 。 •唐氏综合征的检测。MLPA方法可以检测21号染色体上的多个基因或片段的拷贝数变化，如三体或正常，这些变化与唐氏综合征的诊断有关 。 •DNA甲基化分析。MLPA方法可以检测特定基因或位点的DNA甲基化状态，如甲基化或非甲基化，这些状态与基因表达调控和表观遗传学有关 。 |
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