肿瘤NGS基因检测常见问答 ——从样本采集到报告解读全流程

可以送检的样本类型有哪些？

可送检三种样本类型：组织、血液和浆膜积液。

组织样本类型：固定组织（包括手术样本、穿刺或活检样本等浸泡在保存液中）以及经过固定、包埋后的石蜡包埋组织（包括蜡块、蜡卷、切片等）。

浆膜积液样本类型：胸水、腹水、脑脊液。

血液需要使用游离核酸专用保存管保存。

组织样本送检有什么需要注意的吗？

（1）组织样本固定：

1) 样本应完整送检。如需分送不同实验室检测，需要按照同一方向切开。

2) 样本应在1小时内固定。根据不同的检测需求，可以选择福尔马林保存液或RNA保存液等。

3) 固定液与样本体积比应大于10：1，较大样本不能满足上述比例时，应保证组织能完全浸泡在固定液中。

4) 保存样本的样品瓶瓶口尽量足够大，保证取、放样品自如、便捷。

5) 样品瓶应清楚标记样本编号、患者姓名以及样本类型、采集部位和数量等信息。

（2）运储条件及注意事项：

1) 将样本固定好后，适当进行包装，以免液体泄漏，在常温下运输。

2) 样本固定之后，建议72小时内进行包埋处理。

血液样本送检有什么需要注意的吗？

按静脉血采集操作要求，采集10mL全血样本于游离核酸专用保存管中，采血后，轻柔混匀10次，以保证血液与抗凝剂充分混匀。

采集完成后，尽量在48小时内进行血浆分离；最晚不超过72小时。如需运输，使用采血管保护材料将采血管包装好，在常温或4℃运输至实验室检测。

浆膜积液送检有什么需要注意的吗？

（1）脑脊液样本：

1) 采集后的脑脊液收集于专属容器内（建议使用游离核酸专用采血管进行储存），根据检测项目要求采集足量的脑脊液；

样本需要在48小时内送检，最晚不超过72小时。常温或4℃运输。

（2）胸、腹水样本：

1) 需采集不低于100ML的胸水或腹水，使用胸腹水专用保存瓶保存，并做好标记。

2) 采集后的样本需要72小时内送检，常温或4℃运输。

应该优先选择哪种样本类型

进行检测？

对于初次检测，有组织样本的，优选组织样本；如无组织样本，可以送检胸水、腹水、血液等样本。

对于复发、转移或耐药患者，可以根据具体情况，送检穿刺组织、胸水、腹水、脑脊液、血液等样本。

用于ctDNA检测的血液样本，

在什么时间采集合适？

（1） 对于无法获取组织的晚期患者，建议在治疗前或治疗后临床确认耐药进展或复发后采集血液样本。

（2） 进行术后复发监测时，建议术后4周内采集血液样本。然后根据临床情况选择不同时间段进行不间断MRD监测。

以前的原发灶标本和近期转移灶标本，

应该送哪个样本进行检测？

按照样本质量，建议优先选择近期转移灶标本。如条件允许，建议原发灶标本和转移灶标本同时送检，以便进行基因变异图谱比较，以解决组织异质性的问题。

什么检测项目需要送检血液作为对照？

无法提供对照血液有何解决方案?

对于检测基因数目比较多的项目，比如桐树基因105基因和556基因检测，需要对照血同时检测来过滤正常细胞中的变异，以保证体细胞突变检出的准确性。同时，对于对照血液检测会进行遗传性肿瘤或遗传综合征相关致病胚系变异检测来评估遗传风险。

无法提供血液样本作为对照情况下，可以采用口腔脱落上皮细胞作为对照，或者选择确认不含肿瘤细胞的癌旁组织或正常组织作为对照。

检测过程中的质控环节有哪些？

（1）病理质控：所有组织样本进行检测之前，都需要进行HE染色，由病理专家进行阅片判读，以确保每个组织样本都含有足够的肿瘤细胞用于分子检测，最大程度保证检测准确性。

（2）核酸质控：不同的检测项目以及不同的样本类型对核酸提取总量有不同的要求，所有样本核酸提取后均需要通过紫外分光光度计或荧光染料方法进行定量。

（3）文库质控：NGS文库构建完成后，需要通过Qubit对文库浓度进行测定，必要时需要使用生物分析仪对文库片段大小进行测定，以保证文库片段大小和总量符合后续实验要求。

（4）下机数据质控：对下机数据的多项指标进行评估，包含下机数据量、单碱基质量、碱基质量中位数、重复reads百分比、包含接头序列的reads数量、回帖reads百分比、目标区域reads百分比、目标区域的平均深度、目标区域测序均一度等。根据具体检测样本类型不同、检测项目不同，各个指标的要求不同。

样本不合格的情况有哪些？

（1） 血液样本：

（2） 组织样本：

部分数据生信分析指标的解释

（1）下机数据量：又称测序数据量，不同产品的下机数据量不同。

（2）包含接头序列的reads数量: 测序下机产生的fastq.gz文件中reads数目。

（3）单碱基质量: 测序产生的单个碱基质量值，计算方法为Q=-10*lgP，其中P为碱基识别出错的概率。

（4）Q30: 单碱基质量为30，表示测序碱基被识别出错的概率是0.001。

（５）重复reads百分比: 重复reads(duplicated reads)是在NGS文库构建过程中，是PCR对同一个分子进行多次镜像复制的后果。判断标准是：reads的起始和终止位置一样，起点和终点之间的碱基序列一样。重复reads百分比（duplication rate）就是镜像复制出来的reads个数与总reads数的比例。一般计算方法：duplication rate = 1 - unique reads / total reads。

（6）回帖reads百分比: mapping reads rate，是能比对到参考基因组（例如人hg19）上的reads数占总reads数的比例。

（7）目标区域reads百分比: target reads rate，是能比对到panel检测范围上的reads数占比对到参考基因组上总reads数的比例。

（8）目标区域的平均深度: 覆盖目标区域的碱基总量（bp）与目标区域大小的比值。

（9）目标区域测序均一度: 测序的reads在目标区域的测序深度均匀程度的度量，目前用的较多的是大于平均深度的20% 的碱基位点占目标区域碱基位点总数的比例，和大于平均深度的50% 的碱基位点占目标区域碱基位点总数的比例。

为什么血液和组织检测的

测序深度阈值不一样？

血液检测是检测肿瘤细胞经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统的ctDNA（circulating tumor DNA），由于血浆中的ctDNA水平较低，突变等位基因分数在晚期转移性疾病中通常低于10%，在局部晚期非转移性疾病中低于1%。ctDNA水平在癌症早期和治愈性治疗后更低，其突变等位基因频率通常小于0.1%。因此，相较于组织检测，需要提高测序数据量、增加分子标签等方式来提高ctDNA检测灵敏度。

为什么有些项目同时检测

DNA和RNA?

基因检测可以检测多种变异类型，包含：点突变、插入缺失、拷贝数变异和基因重排（基因融合）。

融合基因检测已被纳入多个癌种的NCCN诊疗指南，与DNA-NGS检测相比，RNA-NGS检测能提升融合检出率，降低假阴性。

桐树基因部分检测panel基于RNA-NGS的检测技术，可以全面检测所有融合形式，有可能发现更多的治疗机会。

什么是Panel？

Panel 其实是NGS技术发展起来的一个词语，主要指同时检测多个基因、多个位点。基因检测的 Panel可以称为“基因组合”。几个基因可以是一个 Panel，几十个基因也可以是一个 Panel，几百上千个基因也可以是一个 Panel。就 Panel大小来说，不仅需要看检测基因的数目，还需要看基因所覆盖的区域大小。

桐树基因105基因和556基因检测panel，不仅仅是检测热点变异，设计覆盖了所含基因的全部CDS区域，覆盖全面，尽最大可能检出更多有临床意义的驱动基因变异。

报告显示没有检出任何突变，

这是怎么回事？

说明在产品承诺的检测范围和最低检出限内未检测到有临床意义的基因突变，不排除受检者携带检测范围以外的基因突变，或者频率低于最低检出限的基因突变。

报告显示检出基因突变，

为什么没有用药提示？

说明在多个权威数据库中，这些突变位点目前还没有相关的靶向药物和临床试验信息，所以报告中没有用药提示。

没有基因突变，

是不是一定没有靶向药可用？

不一定，有一些抗血管生成药物以及多靶点的药物在没有检出基因突变的情况下也能使用。

报告里推荐了很多药物，

应该优先选择哪种进行治疗？

关于药物的证据等级：本癌种>其他癌种，FDA/NMPA/诊疗指南>临床证据>临床前证据。

为什么有些患者检出EGFR突变

有靶向药物推荐，其他患者有

EGFR突变却没有推荐药物？

是否有靶向药物推荐不能只看基因，而是要看具体的突变，如果检出的基因突变不是药物的作用靶点，就没有用药推荐。

报告中提示有肿瘤遗传易感基

因突变检出，家属将来也会得

癌症吗？

不一定，患者的直系亲属是否也携带相同的易感突变需要进行基因检测来确认。对于携带遗传易感基因的健康人群，可在医生的指导下，进行早期治疗和健康管理，可有效延缓甚至避免肿瘤的发生。

多次NGS检测结果不一致的

原因有哪些？

导至结果不同的原因可能包括：肿瘤标本异质性，不同平台操作流程的差异，对于基因突变检测种类不同，对于最低丰度检测值不同，空间和时间因素，治疗间隔差异，亚克隆，潜在的生殖细胞 DNA 污染等。

为什么免疫组化显示dMMR，

NGS却未检出MMR相关变异？

没有检出MMR相关变异有可能是MLH1启动子甲基化造成的dMMR；或者MMR变异不在检测范围内。

为什么免疫组化显示pMMR，

NGS却检出MSI-H?

某些MMR蛋白发生错义突变，损失了MMR功能，但仍存在相应抗原被抗体检测识别。因此免疫组化是pMMR，实际上功能已经丧失，而发生MSI-H的情况。或者由四种基因以外的其他基因引起的MSI-H，如POLE/POLD。

哪些患者需要做基因检测？

一般说来，所有肿瘤患者均可以接受基因检测，尝试更多治疗方式。但考虑到经济等多种因素，也可以根据不同肿瘤临床治疗指南的推荐，并结合自身需求，选择是否进行基因检测，以及不同的基因检测Panel等。

临床诊断晚期的患者，一线治疗方案很大程度影响到总生存期。靶向治疗和免疫治疗一般优于单纯的化疗，通过基因检测结果匹配相应的靶向治疗，可延长患者的总生存期。

众多基因检测产品，该如何进行选择？

检测项目的选择需要考虑自身的需求与经济能力，常见基因检测套餐有大panel、中panel、小panel之分，具体的应用场景可以咨询专业的基因检测顾问。

什么情况下需要再次进行基因检测？

肿瘤组织内的基因，持续不断的发生着变异，而且突变过程是完全随机的。有效的治疗手段，会影响突变发生的频率，减少有害突变发生的几率。

因此，治疗一段时间以后，在发生耐药、疾病进展的情况下，可以再进行基因检测，以发现是否有新的基因突变，进而采取新的治疗手段。

是否可以出英文报告？

可以出具。

怎么查询检测进度？

桐树基因提供专属小程序，可以在小程序上查询样本检测进度。

报告遗失怎么办？

2年以内的检测报告可申请重新发送。

如何获得报告解读服务？

可以通过咨询基因检测顾问获得初步的解答，也可以购买报告解读服务得到更全面的解析。