即时检验POCT中的侧流层析LFA技术

POCT是Point of Care Testing的简称，可翻译为“即时检测”或“床旁检验”，是指在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式，是检验医学发展的重要领域， 具有快速检测、现场采样、操作简便等三大方面的优点。POCT行业是近年来体外诊断试剂（IVD）行业发展最快的细分行业之一。在传染病筛查以及急诊领域，相比传统病原学检测方法，POCT更加快速和高效。随着生物技术和工业技术的不断进步，医疗器械行业出现了一种非常重要的发展趋势：向着“简单、便捷、个人健康管理”的方向发展。体积小型化、操作简便化、结果及时化的POCT产品就是在这样的背景下产生并获得了迅速发展。

侧流层析Lateral Flow Assay (LFA)是一个基于试纸条的平台，用显色的方式展现待测靶标的检测结果，时间仅需5 ~ 30分钟。具有易操作、快速、可视化等诸多优点，在POCT技术中应用最为广泛。LFA技术主要以大孔径的微孔滤膜（硝酸纤维素膜，NC膜）为载体，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用侧向流动，与结合垫上的胶体金或乳胶微球表面的标记物发生特异的结合反应，再移动到NC膜上，被固定在NC膜表面的包被物质捕获，聚集在检测带上，通过目测NC膜表面胶体金或乳胶微球聚集条带得到直观的显色结果。其它未结合的物质越过检测带，流入吸水垫中，达到自动分离的目的。LFA产品无需特殊设备或训练有素的人员，并适用于如血液、血清、唾液、尿液等多种常见样本类型。

图1 侧向层析技术原理

LFA的低开发成本和便捷性使其应用扩展到需要快速检测的多个领域，被广泛用于医院、临床实验室或家庭自检等场景。正如在新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的防控与诊疗产品开发过程中，LFA技术起到了至关重要的作用。以下我们分别以SARS-CoV-2的几个相关检测物质（如抗原、中和抗体、核酸）为例来简述几种典型的LFA原理和应用。

免疫层析试纸的检测原理主要有两种：夹心法和竞争法。夹心法，也称为双抗夹心ELISA法。

图2. 夹心法免疫层析原理

新冠病毒感染人体后会刺激人浆细胞产生特异性抗体。试纸的结合垫内包被有胶体金或乳胶微球标记的新冠病毒核衣壳蛋白（N蛋白）抗原第一种特异性抗体，当加入的样本中含有新冠病毒时，可以与病毒N蛋白发生特异性结合，顺着液流到达T线时，T线上预先标记的N蛋白抗原第二种特异性抗体再次与N蛋白结合，因此可将胶体金或乳胶微球固定在T线上显现出明显的色带，呈现阳性结果。C线包被有二抗，不论样本中N蛋白抗原存在与否都可以与胶体金或乳胶微球标记的抗体结合，从而显现出条带，用于判断层析过程是否有效。

利用竞争法检测时，当样品中的待检测物与金标抗原或抗体结合后，就能阻断金标抗原或抗体与T线上的包被物结合，此时胶体金或乳胶微球颗粒在T线上的聚集减弱，不显色带或呈现较弱色带，多余的金标抗原或抗体与C线上的抗体结合从而聚集显色。而如果样品中不含有待检测物，也就不能阻断金标抗原或抗体与T线上的包被物结合，此时T线上将发生胶体金或乳胶微球的聚集显色，同样，C线也因金颗粒的聚集而显色。

新冠中和抗体是一种可特异性阻断新冠RBD蛋白与人血管紧张素转换酶2（ACE2）结合的中和性抗体，在人体对新冠病毒体液免疫机制中起着至关重要的作用，也是疫苗开发与效价评估的重要指标。基于竞争法免疫层析的原理，在层析试纸上也可实现对新冠中和抗体的便捷定性检测。首先将RBD抗原修饰在胶体金或乳胶微球上固定于结合垫中，将ACE2抗原固定在NC膜的T线位置，能与胶体金或乳胶微球标记的RBD特异结合的抗体固定在NC膜的C线位置。当样品中含有新冠中和抗体时，中和抗体会与RBD结合，进而减少了RBD修饰胶体金或乳胶微球与T线处ACE2的结合，T线色度显著下降，从而可定性识别出样本中是否含有中和抗体。

图3. 竞争法免疫层析原理

核酸层析试纸的检测原理多以夹心法为基础，首先使用两种小分子标签：硫氰酸荧光素(FITC)和生物素(Biotin)分别标记上下游扩增引物，核酸模板通过不同方式（如PCR、LAMP、RPA等）扩增后，在扩增产物中同时引入了FITC与Biotin，在核酸层析试纸的结合垫中包被有抗FITC抗体修饰的胶体金或乳胶微球，因此扩增产物加入时会与胶体金或乳胶微球结合往T线流动；T线处包被有能与biotin快速高效结合得链霉亲和素（SA），因此胶体金或乳胶微球可以在T线处被固定下来显现出明显的色带，呈现阳性结果。同理阴性样本因无扩增产物，胶体金或乳胶微球不会被固定在T线位置而不显色。试纸C线处包被有能与抗FITC抗体结合的二抗，可以结合流动中的胶体金或乳胶微球从而判断层析是否正常。

新冠核酸层析检测产品应用了同样的原理，目前已有多家厂商开发了基于RT-LAMP、RT-PCR、RT-RPA等多种扩增方式的核酸层析产品，核心原理都是在扩增产物中同时引入了FITC与Biotin的标记；值得一提的是，核酸层析试纸可以通过第三种标记物的引入如地高辛等，实现多靶标检测。核酸层析试纸方法可以使核酸检测更为便捷直观、满足POCT检测的需求，但是与样本中的蛋白类检测物不同，核酸的扩增过程往往要求很高的反应精度，同时容易产生的气溶胶污染也对产品的设计优化提出了挑战。

图4. 核酸层析

CRISPR系统作为细菌获得性免疫的重要组成部分，在分子诊断领域带给大家的是无限想象空间。通过合理的CRISPR探针与试纸设计，CRISPR-Cas层析系统能够判读出探针的被剪切状态，从而判断样本中是否存在待检测的靶标。一般的设计原理是：报告探针是一种携带末端标签Biotin与FITC的短的单链DNA或RNA分子，在待检测靶标存在情况下，CRISPR-Cas的反式切割活性被激活，进而将探针剪切，导至终端标签Biotin与FITC的分离；CRISPR-Cas层析试纸与上述核酸试纸类似，在结合垫均包被了抗FITC抗体标记的胶体金或乳胶微球，不同的是，C线位于T线之前，C线中包被了可与Biotin结合的SA；当样本中靶标不存在时，探针上Biotin与FITC的标签完整，胶体金或乳胶微球会被全部固定在C线上，从而T线不显色；当样本中靶标存在时，探针上Biotin与FITC因Cas酶激活的反式切割活性而分离，部分胶体金或乳胶微球上因没有Biotin标签因此不会被C线截留，从而可以继续往T线处流动，在T线处包被有可与抗FITC抗体结合的二抗，在此处胶体金或乳胶微球被固定呈现出色带，表示阳性结果。

目前还未有基于CRISPR-Cas层析方法的成熟新冠核酸检测的已上市产品，但是源于CRISPR诊断系统的高灵敏度和特异性的优势，包括新冠核酸在内的多种病原体核酸检测研究工作得到了广泛的开展，研究结果展示出优异的性能和巨大的POCT产品价值，有望在CRISPR诊断体系中画上浓墨重彩的一笔。

图5. CRISPR-CAS层析

综上所述，基于LFA侧流层析技术的POCT产品在检测抗原、抗体、核酸等多种标志物时具有丰富的方案路径和研究基础，是POCT产品线中非常重要的组成部分。在应对类似新冠病毒等世界规模的重大传染病上，LFA产品也起到了对疾病诊疗、防控等方面的关键作用，值得广大科研工作者和IVD企业开发人员继续加以探索。尤其是结合CRISPR-Cas这一具有广阔应用前景的核酸检测技术，有望取得突破性的进展。