《CDD》:液体活检在NSCLC患者免疫治疗中的应用

肿瘤免疫治疗是一种与传统的化疗、放疗和手术完全不同的肿瘤治疗方法。它应用免疫学原理和方法来提高肿瘤细胞的免疫原性及其对效应细胞杀伤的敏感性，刺激和增强机体的抗肿瘤免疫反应，从而达到控制和清除肿瘤的目的。主要的肿瘤免疫治疗方法如下图所示，包括免疫检查点抑制剂（ICIs），包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、B7-H3、TIM3等；过继免疫细胞疗法，主要包括嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗、自然杀伤（NK）细胞治疗和γδT细胞治疗等；肿瘤疫苗（如肿瘤细胞、肿瘤相关蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的基因等）；基于细胞因子的治疗（例如IL-2、IL-21和GM-CSF）等。

尽管近年来肿瘤免疫疗法取得了令人印象深刻的结果，但相当一部分患者没有从免疫疗法中受益，其确切机制尚不清楚。准确的生物标志物对于筛选免疫疗法益处人群和预测免疫相关不良事件（irAE）至关重要。目前的免疫治疗指南主要基于患者原发肿瘤的PD-L1水平或最近的肿瘤突变负荷（TMB）水平，以确定他们是否有资格接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗。然而，这些生物标志物并不是最准确的。

PD-L1表达：虽然PD-L1表达是最公认的抗PD1/PD-L1 ICIs反应的预测因子，并用于指导转移性NSCLC的治疗决策，但并不完全准确。一些PD-L1高表达的患者在临床上没有从ICI治疗中获益，而不表达PD-L1的患者可能对这种治疗有反应。此外，PD-L1可以在肿瘤细胞和免疫细胞中表达，并且存在肿瘤内和时空异质性，其检测受到主观解释和不同平台缺乏标准化的影响。

TMB：肿瘤突变负荷（TMB）作为治疗效果的标志物，也有不足之处。并非所有TMB高的患者都对ICIs有反应，TMB低的患者不能排除免疫疗法反应的可能性。最后，没有明确定义的阈值来定义TMB的高或低水平。

其他基于肿瘤的标志物：通过监测免疫微环境的生物标志物，如CD4+和CD8+T细胞亚群、中性粒细胞/淋巴细胞比率、细胞因子等，可以反映免疫系统和肿瘤细胞的博弈状态。肿瘤微环境（TME）是肿瘤细胞存在的周围环境，包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎症细胞、信号分子和细胞外基质。它在肿瘤细胞和免疫系统之间复杂的相互作用中发挥着重要作用。因此，所有这些参与者都有可能用于生物标志物研究。

几项研究评估了血浆cfDNA水平作为ICIs治疗患者临床获益预测指标的效用。NSCLC治疗期间cfDNA水平的降低与更好的结果相关，这支持了其作为预测生物标志物的潜力。但由于cfDNA的产生在癌症类型内部和之间都不同，cfDNA的总水平不能用作信息性生物标记物。

总ctDNA水平检测可能是一种简便的方法，因为在包括NSCLC在内的许多类型的肿瘤中，总ctDNA含量已被证明与肿瘤质量大小有关。此外，ctDNA对处于不同疾病状态的NSCLC患者显示出潜在的临床预测价值。ctDNA还可以作为一种非侵入性工具来检测与免疫疗法敏感性相关的点突变。PTEN或STK11突变的NSCLC患者预后不佳，而KRAS和TP53基因的颠换突变与更好的反应有关，可据此确定那些可从ICIs治疗中受益的患者。

ctDNA应用中目前的挑战主要是缺乏统一的基线风险分层阈值，以及具有不同覆盖深度、片段大小和检测极限的多种检测方法。ctDNA在临床实践中的应用目前是有限的，但在不久的将来，早期识别反应者和评估反应仍然是可能的。

CTC检测在临床环境中的具体应用场景包括高危人群的早期筛查、确诊患者的准确分期、早期患者复发和转移的术后监测、治疗开始前的预后判断以及晚期患者每个治疗周期后的疗效评估，实时分析分子靶标（如EGFR、HER2、ALK等），以预测相关药物的疗效等。除上述情况外，已知45-93%的CTC样品可以评估PD-L1。PD-L1阳性CTC与ICI治疗患者预后之间的关系，结果仍有争议。评估CTC和组织中PD-L1表达一致性的研究结果也存在争议。需要更多的研究来评估用于CTC检测和分析的标准化方法和PD-L1抗体，并进一步探索PD-L1在CTC上的表达与免疫治疗预后之间的关系。

与ctDNA相比，CTC具有细胞形态完整和细胞内物质保存更完整的优点。除了涵盖ctDNA的所有测定外，CTC测定还可以提供转录组学、基因组学和蛋白质组学信息。例如，吲哚胺-2，3-双加氧酶（IDO）在CTC中的表达已显示出预测免疫治疗反应的有希望的结果，IDO+ CTC与较短的PFS和OS有关。CTC的高通量测序和单细胞RNA测序（scRNA-seq）等研究也有助于将来CTC组学研究扩展到NSCLC的免疫治疗反应。总的来说，CTC计数可能是ICI治疗过程中最有前途的生物标志物。然而，在CTC转化为临床之前，需要解决技术问题和有争议的研究结果。

外泌体是细胞外囊泡最常见的亚型，积极参与癌症的发展、转移和耐药性，这使其成为癌症筛查、诊断和监测的生物标志物。在40例晚期NSCLC患者中，PD-L1 mRNA变化≥2.04的患者的PFS、OS和最佳反应（BOR）更好。这表明，在ICIs治疗早期，PD-L1 mRNA和/或外泌体PD-L1的表达升高可作为晚期NSCLC患者疗效和预后的阳性生物标志物。然而，关于PD-L1在外泌体和组织中表达的一致性，有相互矛盾的发现。

Peng等人探讨了血浆来源的外泌体miRNA在ICI治疗前患者选择中的作用。来自hsa-miR-320家族的三种miRNA（hsa-miR-320b、hsa-miR-320c和hsa-miR-320d）被发现是有希望的预测因子，其中一种被确定为抗PD-1治疗的可能靶点（hsa-micro-125b-5p）。在进行性疾病患者中，所有三种miRNA的上调都与anti-PD-1不良反应有关。此外，hsa-miR-125b-5p在对anti-PD-1治疗有反应的患者中下调。因此，在抗PD-1治疗期间持续监测hsa-miR-125b-5p水平被认为是一种治疗中的诊断工具。

总之，基于外泌体的PD-L1状态评估是筛选可能受益于免疫疗法的NSCLC患者的一种很有前途的生物标志物。使外泌体在临床实践中的实施可行的第一个也是最重要的挑战是外泌体分离和纯化方法的标准化。

目前关于非编码RNA在肺癌免疫治疗中的作用的研究主要集中在miRNAs上。某些循环miRNA的变化会影响ICI治疗期间的反应和存活。使用miRNA谱的一项发现分析揭示了19名对免疫疗法有反应的NSCLC患者和27名没有反应的患者之间27种miRNA表达的不同谱（22种高表达，5种低表达）。然后，在一个独立的患者队列中，验证了10种高表达的miRNA。这些结果都支持miRNA作为非侵袭性预测NSCLC患者免疫治疗反应的生物标志物。此外，lncRNAs和circRNAs也被发现是潜在的癌症生物标记物。例如，lncRNAs XIST和HIF1A-AS1在NSCLC患者的血清中显著增加。另一项研究确定了一组在NSCLC中具有预后作用的circRNAs，包括两种过表达（circ-0005962和circ-0003958）和低表达（has-circ-0086414和has-cirk-0001936）circRNA。总之，循环ncRNA作为临床疾病管理的合适生物标志物非常有前景。

T细胞受体（TCR）是T细胞表面的一种特征性标记，用于识别抗原。每个T细胞都有一个独特的TCR序列，个体的TCR库由不同的TCR顺序、分布和频率组成。TCR序列的变异可以通过高通量测序检测出来，并且已经在包括非小细胞肺癌在内的多种癌症中进行了研究。Han等人的一项研究聚焦于40名接受抗PD-1或抗PD-L1治疗的NSCLC患者的TCD8+PD-1+细胞的TCR库。TCR变异性高的患者在治疗前后的平均PFS明显高于TCR变异率低的患者。TCR的多样性和克隆性可作为监测NSCLC患者对免疫疗法反应的生物标志物。然而，在临床上实施之前，需要克服由于功能不同克隆的聚集或假克隆的存在而导至的高假阳性率的挑战。

淋巴细胞在免疫疗法诱导的抗肿瘤反应中发挥核心作用。一项研究发现较高的自然杀伤（NK）细胞水平和CD4+/CD8+细胞比率预示着ICI治疗基线时PFS延长。无论ICI还是ICI联合治疗，基线时调节性T细胞（Tregs）水平较低的NSCLC患者都取得了更好的结果。此外，几项研究将接受免疫疗法治疗的晚期非小细胞肺癌的中性粒细胞与淋巴细胞比率（NLR）与OS、PFS和ORR联系起来。NLR和血小板与淋巴细胞比率（PLR）也被发现是ICIs治疗的晚期NSCLC患者irAE的预测因素。尽管从常规血液分析中获得的PLR和NLR等指标为监测治疗结果提供了有趣的机会，但循环免疫细胞仍然缺乏精心设计的研究来证明其作为生物标志物的真正潜力。

细胞因子在与癌症进展密切相关的炎性肿瘤微环境中发挥着关键作用。它们在细胞之间传递信息，促进免疫细胞募集到肿瘤微环境中，还影响免疫检查点受体和配体的表达，从而影响ICI反应。在Boutsikou等人的研究中，在诊断时和开始免疫治疗3个月后通过流式细胞术分析26名NSCLC患者的细胞因子，发现IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12水平较高的患者比水平较低的患者表现出改善的ICI反应和延长的生存期。然而，目前的研究存在一些局限性，例如参与研究的患者数量少，治疗方法不同，以及缺乏明确的界限。验证循环细胞因子的潜力并将其转化为临床应用还需要进一步的研究。

基于粪便的肠道微生物群已被发现参与肠道和肠外组织中各种类型癌症的发展、进展和转移。此外，肠道微生物可参与炎症诱导或通过免疫抑制间接参与癌症治疗，最终影响抗肿瘤治疗的结果。最近的临床前和临床研究将肠道微生物群组成与ICIs的特异性和毒性反应联系起来。微生物群的研究仍处于初级阶段，但它在监测非小细胞肺癌免疫疗法患者方面有很大的前景。

作为一种获取生物样本的非侵入性方法，液体活检在癌症治疗中的重要性日益增加。研究和分析平台的不断发展让基于cfDNA的液体活检诊断进入下一个发展阶段。cfDNA中与免疫疗法敏感或耐药基因相关的体细胞突变的发现将有助于医生做出更好的治疗决定，但cfDNA的分离和分析仍然具有挑战性。血浆cfDNA有多种来源，如胎儿和种系，以及造血来源的cfDNA突变，这些突变可能被误认为是肿瘤来源的突变，导至检测结果容易出现假阳性。有人认为，血浆ctDNA水平是治疗反应的标志，因为ctDNA的减少与接受ICI治疗的患者的预后改善有关。然而，对于衡量总体水平的方法还没有达成明确的共识。

CTC作为具有肿瘤特异性信息的完整活细胞，也可用于癌症的诊断和治疗评估。然而，CTC的鉴定和分离技术远远落后于ctDNA。非小细胞癌患者血液中检测到的CTC数量始终低于其他癌症类型。这可能至少部分是由于CTC分离技术严重依赖于只能识别上皮细胞的EpCAM依赖性方法。需要新的标志物来检测经历上皮-间充质转化（EMT）的肿瘤细胞。

目前，仍有许多工作要做。这些液体活检方法大多处于正在进行的研究阶段，必须进行大型前瞻性临床试验，以提供其临床实用性的证据。此外，由于免疫微环境的复杂性、多种因素的相互作用以及当前知识的局限性，许多生物标志物的预测作用并不是绝对的。在临床实践中，不应使用单一的指标作为评估标准。液体活检数据应与组织活检、影像学检查结果、肿瘤标志物等临床指标相结合，实时全面监测和指导NSCLC患者的临床治疗，提供更准确的患者实际情况信息。总之，液体活检为探索免疫疗法反应的生物标志物提供了前所未有的可能性。尽管在临床实践之前需要更大的研究队列和独立验证，但其在预测NSCLC患者免疫反应方面的潜在价值是毋庸置疑的。希望在不久的将来，随着技术手段的进步，新的生物标志物不断被发现，并开发出更多经验证的多组学、多参数预测模型，以帮助临床医生在免疫疗法预测和方案开发方面实现更大的优化和精确性。