“吐露”心声：1921年，非洲出现的一头眼鼻分泌粘稠物、皮肤绀紫、并且发着高烧、呼吸困难的猪拉开了“非洲猪瘟”的序幕。尽管非洲猪瘟并不会造成“人畜共患病”的现象，但该病高达100%的急性致死率仍旧给人类畜牧业造成了极大的损失。如何快速检测非洲猪瘟成了一道亟待攻克的难题。本周，小编为大家带来了运用CRISPR技术快速现场检测非洲猪瘟病毒的方法，快和小编一起看看吧！ 非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，病死率接近100%。我国自2018年8月确诊第一例ASF以来[1,2]，已经捕杀或活埋一百多万头猪，使国家养猪业蒙受巨大损失。
目前，ASF暂无安全有效的疫苗可用，因此，快速、灵敏和可在现场执行的非洲猪瘟检测对于疾病监测和控制非常重要。在现有的诊断方法中，核酸检测因其较高的灵敏度和特异性而成为ASF诊断中应用最广泛的诊断方法[3]。核酸诊断的金标准是qPCR，它可以对低浓度的样本进行准确检测，但该方法需要特殊的仪器平台及对操作者较高的专业技术要求，限制了其在现场检测中的应用。因此，一些便携式核酸检测系统，如高效的等温扩增方法，包括环介导等温扩增（LAMP）[4]、重组聚合酶扩增（RPA）[5]和指数扩增反应（EXPAR）[6]等，已被开发出来作为传统qPCR方法的替代法。但等温扩增存在一些非特异性问题，检测灵敏度低于qPCR，且存在假阳性的风险。 近年来，具有反式切割活性的CRISPR/Cas诊断系统展现了其特有的高灵敏度和高特异性，随之出现了一些超敏快速的CRISPR/Cas诊断技术，如SHERLOCK、HOLMES等，这些技术将在ASFV现场快速检测领域展现其强大的应用潜力。
Wang等[7]利用RPA结合CRISPR/Cas12a系统，针对ASFV的保守基因p72进行RPA扩增，将扩增子与Cas12a/crRNA混合。当体系中存在ASFV靶序列，就会与Cas12a/crRNA形成三元复合体，激发其反式切割活性，切割体系中的报告探针，从而产生荧光信号，见图2。作者发现RPA结合CRISPR/Cas12a检测灵敏度比商品化的qPCR试剂更高。且该方法特异性很高，只能检测出ASFV，而对其他病毒样本均无反应。 图2. CRISPR-Cas12a对ASFV检测的应用示意图 Ren等[8] 开发了一种基于RPA-CRISPR/LwCas13a的核酸检测方法来诊断ASFV。作为一种高度灵敏的方法，该法通过RPA扩增后对扩增子进行转录，体系中存在ASFV转录靶标时就会与Cas13a结合，激活其反式切割活性，并切割报告探针产生荧光信号，检测原理见图3A，该方法可以检测到低至单个拷贝的ASFV质粒和基因组DNA。同时作者也开发了一种试纸条与RPA-CRISPR结合用于ASFV检测的方法，见图3B，具有与TaqMan qPCR相同的灵敏度。同样，RPA-CRISPR能够将ASFV基因组DNA与其他猪病病毒的DNA/RNA区别开，没有任何交叉反应。 图3. 基于RPA-CRISPR的横向流条检测示意图
Yang等[9]首次采用LAMP结合CRISPR系统研发了一种ASFV新型检测方法，实现现场便捷快速检测。该研究基于CRISPR/Cas12a酶具有反式剪切活性的特性，通过crRNA的引导识别目的DNA序列后，可以反式切割探针分子发出荧光信号，见图4。LAMP-CRISPR检测方法采用LAMP进行目的序列的扩增富集，既保留了LAMP方法的高敏感性，同时又通过CRISPR的靶向提升了检测方法的特异性。临床样本检测水平与实时荧光定量PCR法相当，在一个反应管中一步完成反应，有效避免了气溶胶污染。作为一种高度灵敏的可视化检测方法，LAMP-CRISPR在基层ASFV的监测防疫中具有巨大潜力。 Jisun Ki等[10]利用CRISPR/Cas12a系统结合脲酶开发了一款比色生物传感系统，用于对ASFV的快速检测。该方法是利用CRISPR-Cas12a在crRNA引导下特异性识别ASFV靶标序列，从而被激发其反式切割活性，切割磁珠锚定脲酶偶联的单链寡核苷酸（urODN），将脲酶从磁珠上释放出来，而后尿素被水解，溶液PH升高，颜色变红，检测原理见图5。若无ASFV靶标存在，则溶液不变色。该方法的优点是无需经过复杂的靶基因扩增过程即可检测出病毒的存在，且该方法操作简单，无需大型、专业的仪器设备。 
图5. 基于CRISPR/Cas12a系统下利用脲酶进行ASF检测的示意图2023年3月20日，农业农村部印发《关于做好春季动物疫病防控工作的通知》[11]，部署加强非洲猪瘟等重大动物疫病常态化防控和重点人畜共患病源头防控，维护畜牧业生产安全、公共卫生安全和国家生物安全。动物疫病排查和入场采样监测对动物疫病的防控至关重要。ToloBio公司具有自主研发生产的各种CRISPR/Cas蛋白以及国际领先的CRISPR技术，能够实现快速、简便、超敏、高特异的动物疫病病毒检测，助力动物疫病防控，欢迎大家拨打400-032-6070咨询！
1. 沈阳市沈北新区发生一例非洲猪瘟疫情．央广网[引用日期2018-08-04] 2. 一场没有硝烟的战斗——权威专家回应非洲猪瘟疫情防控热点．海外网[引用日期2018-11-24] 3. Capo, A,;Calabrese, A.;et al. SPR-Based Detection of ASF Virus in Cells. Int. J. Mol. Sci.2022, 23, 7463. 4.Tomita, N,; Mori, Y.;et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 2008, 3, 877−88. 5.Lobato, I.M,;O’Sullivan C.K.Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends Analyt.Chem. 2018, 98, 19−35. 6. Reid, M.S.; Le, X.C.; Zhang, H. Exponential Isothermal Amplification of Nucleic Acids and Assays for Proteins, Cells, Small Molecules, and Enzyme Activities: An EXPAR Example. Angew. Chem., Int. Ed. 2018, 57, 11856−1186. 7. Wang,X.P.;et al. Development and clinical application of a novel CRISPR-Cas12a based assay for the detection of African swine fever virus. BMC Microbiology.2020, 20(1):282. 8. Ren,M.S.;etal.Development of A Super-Sensitive Diagnostic Method for African Swine Fever Using CRISPR Techniques. Virol Sin. 2021,36(2): 220–230. 9. Yang.B.;et al. LAMP assay coupled with CRISPR/Cas12a system for portable detection of African swine fever virus. Transbound Emerg Dis. 2022,69(4):e216-e223. 10. Jisun Ki,; Hee-Kyung Na.;et al. CRISPR/Cas-Assisted Colorimetric Biosensor for Point-of-Use Testing for African Swine Fever Virus. ACS Sens. 2022 Dec 23; 7(12): 3940–3946. 11. 农业农村部部署做好春季动物疫病防控工作 (moa.gov.cn)
|
/3 
浙公网安备33010802005999号 
