致病菌对人类健康构成严重威胁，及时、灵敏地检测病原体对于确诊感染源、预防疾病传播和改善患者治疗至关重要。研究表明细菌16S rRNA包含种间差异信息，典型的细菌拥有约10000个16S rRNA拷贝；将16S rRNA作为检测模板对于低浓度病原体的即时检测（POCT）具有重大意义。 侧流层析技术（LFA）一种集分离与检测为一体的通用工具，但常规的二元“是/否”定性读数限制了其应用。目前，基于智能手机的读取器在比色或荧光LFA中很受欢迎；通过手机相机拍取荧光图片，再由图像处理软件（如Image J）转换为绝对值；在拍照进行定量分析时，照明条件、光学设置和焦距在内的各种因素都会给最终结果带来干扰。因此，构建一种直接定量检测LFA信号、没有复杂的操作规则和数据转换的便携式检测设备能够积极推动LFA在病原体核酸POCT中的应用。近日，哈尔滨工业大学（深圳）李迎春教授团队提出了一种杂交链式反应介导的多位点核酸外切酶III的一锅法、超灵敏等温扩增技术（HCR/Exo-III扩增）和便携式荧光阵列试纸条定量检测设备（PFD-LFA）用于多种细菌16S rRNA的POCT。在该工作中，他们设计了多功能的双茎环DNA发夹探针（H1），其上环茎锁定启动Exo III扩增的特异性引物（H1P），而下环茎用于HCR扩增；当目标物引发HCR反应后会将H1发夹之前锁定的H1P释放出来形成ssH1P；ssH1P进一步与H3杂交形成H3 3'-钝端以提供多个Exo III作用位点；其中Exo III触发H3的消化以释放ssH1P和残余的H3产物（H3P）。释放的ssH1P将参与H3识别和消化的下一个周期，而H3P作为最终扩增产物将在LFA中发挥桥梁作用。作为概念验证，选择了来自金黄色葡萄球菌（Sa）、单核细胞增生李斯特菌（Lm）和鼠伤寒沙门氏菌（St）的16S rRNA作为检测模型。当目标物的扩增产物（Sa amplicon、Lm amplicon和St amplicon）与DNA-CdTe/CdS荧光探针混合并在试纸条上层析15分钟后，将试纸条插入便携式荧光检测设备，便可直接读取每个细菌在测试区（TZ-Sa、TZ-Lm和TZ-St）的荧光信号。最终，该传感平台不仅实现了对合成的16S rRNA标准片段（T-Sa、T-Lm和T-St）的灵敏检测，而且对从真实细菌中提取出的天然16S rRNA也表现出优异的检测性能。
图1.（A）基于HCR/Exo-III信号放大的one-pot核酸扩增原理图。（B）荧光侧流层析反应示意图和便携式荧光设备用于检测多种细菌16S rRNA的流程图。
图2.（A）CdTe/CdS量子点的TEM表征，（B）CdTe/CdS量子点的粒径分析，（C）CdTe/CdS量子点的XPS表征，（D）DNA和CdTe/CdS QDs交联反应示意图，（E）CdTe/CdS、DNA-NH2和DNA-CdTe/CdS复合探针的Uv-vis表征，（F）CdTe/CdS QDs和DNA-CdTe/CdS复合探针的荧光光谱表征。
图3.（A）T-Sa、（B）T-Lm和（C）T-St的不同浓度（10-2、10-1、1、10、102、103、104、105、106 fM）与微型荧光计检测到的荧光响应之间的相关性。日立F-4600荧光计测定的（D）T-Sa、（E）T-Lm和（F）T-St的相应荧光发射光谱。
图4. 基于HCR/Exo-III扩增的便携式荧光定量试纸条分析设备用于定量检测（A）金黄色葡萄球菌Sa，（B）单增李斯特菌Lm和（C）鼠伤寒沙门氏菌St的16S rRNA，线性区间 (102 ~106 CFU/mL)。（D）三种细菌16S rRNA的正交检测结果。相关成果近期发表在Analytical Chemistry 期刊上，哈尔滨工业大学（深圳）的博士研究生彭锌为第一作者，通讯作者为哈尔滨工业大学（深圳）的李迎春教授和刘江博士。Ultrasensitive Hybridization Chain Reaction-Assisted Multisite Exonuclease III Amplification Strategy Combined with a Direct Quantitative Fluorescence Lateral Flow Technique for Multiple Bacterial 16S rRNA DetectionXin Peng, Xuecui Mei, Jiao Yang, Jiang Liu*, and Yingchun Li*Anal. Chem., 2023, 95, 5807–5814, DOI: 10.1021/acs.analchem.3c00270李迎春：哈尔滨工业大学（深圳）教授，入选国家高层次人才青年计划（2012），曾担任全国青联委员（2015）、中国青科协理事（2015）、江苏省“双创人才”（2015）。主要从事功能性高分子和传感器的研发，设计并制作了满足不同使用情景的系列传感器检测器件和设备，应用的领域包括疾病诊断、临床药物监测、食品安全、环境监测等。主持国家级、省部级各类课题20余项，其中国家自然科学基金5项。以第一/通讯作者发表SCI收录论文近百篇，EIS高被引5篇，亮点文章4篇。以第一完成人身份授权国家专利7项，与企业合作并实现成果转化3项，在三年期间创造经济效益超过1500万元。https://www.x-mol.com/university/faculty/50154刘江：哈尔滨工业大学（深圳）博士后，主要从事创新传感方法及微型传感器件的研发及其在药物分析、医学诊断中的应用。曾荣获省级优秀学位论文、3次荣获研究生国家奖学金、哈尔滨工业大学（深圳）优秀博士后等荣誉，以第一作者在Adv. Funct. Mater., Nano Research, Anal. Chem., Biosens. Bioelectron.等国际刊物上发表SCI收录论文十余篇（ESI高被引论文1篇，IF>5的论文10篇）。已申请国家发明专利6项（3项已授权），主持国家自然科学基金青年基金1项、中国博士后科学基金1项、广东省区域联合－青年基金1项，参与4项国家自然科学基金及多项省市级项目的立项申报与研究。曾参与项目获得2017年新疆生产建设兵团科技进步一等奖；研究成果在第25届全国发明展览会上获得“发明创业奖项目奖”银奖。
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