对新冠肺炎进行快速筛查和检测，可以识别受感染的高危人群，从而减少病毒传播，更好地预防和控制新型冠肺炎。快速检测和适当隔离治疗是应对流行病的最佳策略。对于新冠肺炎的商业快速检测，根据紧急使用授权（EUA）（截至2023年1月1日），可提供59种SARS-CoV-2抗原诊断测试。尽管已开发出具有先进诊断性能的技术，RT–qPCR检测仍然被认为是新冠肺炎诊断的金标准。RT-qPCR成本高，操作时间长（4-6 h） ，现场频繁检测具有挑战性，昂贵的实验室设备和繁琐的RNA提取步骤，限制了其POCT中的应用。 关于分散的高频检测，侧流分析（LFA）平台被确认为护理点和自我检测的最佳平台，因为它们提供了方便、易用、一步到位、一次性和快速的结果，且符合世界卫生组织（WHO）的“ASSURED”标准（价格合理、敏感、具体、用户友好、快速可靠、无设备、可交付给最终用户）。LFA平台对于高病毒载量显示出良好的准确性；然而，准确性随着病毒载量的降低而急剧下降，产生更多的假阴性，并增加病毒进一步传播的风险。 近日，一组来自韩国的研究团队在杂志Nature Communications上发表了一篇题为“PCR-like performance of rapid test with permselective tunable nanotrap”的文章。文章描述了研究团队开发的一种具有增强敏感性和特异性的LFA生物工程富集工具（BEETLES2），可配合商业新冠肺炎LFA试剂盒使用可提高商业LFA临床性能。BEETLES2是一种用红细胞膜（RBCM）和纳米多孔阳极氧化铝（AAO）制备的纳米陷阱（Nanotrap）。高AAO通量和水通道蛋白（AQP）的组合允许在3 分钟，实现严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型病毒、核衣壳（N）蛋白和免疫球蛋白G（IgG）抗体的富集。检测限（LOD）提高了20倍，当应用于患者样本时显示出增强的诊断敏感性、特异性和准确性。
图片来源：Nature communications 用于增强新冠肺炎诊断的纳米陷阱 （BEETLES2） 在AAO膜上由RBCM组成的混合过滤器称为BEETLES2膜。BEETLES2依据分子的大小和电荷，富集并分离生物分子（如下图）。 对于新冠肺炎的应用，重点关注N蛋白、SARS-CoV-2病毒和IgG抗体的富集。采集样本后，通过BEETLES2富集靶分子，应用成熟的诊断工具，如商业LFA和RT-qPCR，提高了检测性能。 BEETLES2的主要优点是病毒蛋白和病毒本身可以在各种缓冲液下富集，包括磷酸盐缓冲盐水（PBS）、唾液、血清和病毒转运介质（VTM）。此外，可以消除大量的蛋白质（白蛋白）和小的抑制剂。较大的生物分子，如IgG（~150 kDa）富集是因为较大的蛋白质不能自由通过BEETLES2膜。N蛋白在生理条件下带正电荷，而BSA带负电荷。因此，BEETLES2只富集了N蛋白，而带负电荷的BSA自由通过BEETLES2膜并被过滤掉。
BEETLES2进行COVID-19诊断的示意图。 图片来源：Nature communications 纳米陷阱的物理化学表征 BEETLES2膜由RBCM和一种蜂窝状纳米结构AAO膜组成，具有排列的20 nm孔用作基底（图a）。AAO膜本身没有渗透选择性，只负责基于尺寸的分离。为了增加可调的渗透选择性，研究团队通过囊泡融合方法将RBCM功能化到AAO膜上（图b）。 未涂覆的AAO膜显示出网状网络，有助于水和蛋白质的渗透。相反，BEETLES2膜具有光滑的表面，表明RBCM悬浮液完全覆盖了多孔结构，并形成了多层RBCM结构。由于RBCM充当物理屏障，在没有压力的情况下BEETLES2膜没有渗透选择性。当施加的压力>0.5 bar时，具有渗透选择性。
纳米陷阱的物理化学表征。 图片来源：Nature communications BEETLES2膜的可调渗透选择性 研究团队根据压力、分子大小、电荷和缓冲条件对BEETLES2膜富集进行了分类。AAO膜具有大的孔径，允许白蛋白、病毒蛋白和免疫球蛋白等各种蛋白质通过。然而，BEETLES2膜可以选择性地阻断这些蛋白质。但在外部压力下，带负电的小分子（如白蛋白）可以很容易地穿透BEETLES2膜。 在生理条件下测试带负电的BSA和带正电的N蛋白。对于带正电的N蛋白，无论压力如何，通过纳米液滴测量的富集度都超过了24倍。相反，带负电的BSA显示出对压力的强烈依赖性。随着压力的增加，BSA自由通过BEETLES2膜，没有显著富集。IgG分子量（MW）为150 kDa，由于尺寸过滤，无论压力如何，IgG显示出18倍的富集。 这些结果表明，BEETLES2膜在生理条件下通过带负电荷的磷脂和带正电荷的病毒蛋白的静电相互作用，完全阻断带正电荷蛋白质的渗透。
BEETLES2膜的可调渗透选择性。 图片来源：Nature communications BEETLES2膜增强LFA检测性能 与没有BEETLES2浓缩的商业LFA抗原检测相比，通过BEETLES2富集的所有比色信号都增加了，表明检测灵敏度更高，LOD提高了20倍。 与新冠肺炎抗原试验类似，使用样品富集过程观察到新冠肺炎抗体IgG灵敏度提高，LOD提高了20倍，在LFA测定中显示出很大的适用性。此外，由于流感A/B的N蛋白和IgG性质与SARS-CoV-2相似，因此BEETLES2也可能适用于流感A/B或其他靶病毒。与新冠肺炎抗原测试类似，通过样品富集过程获得了增强的比色信号。
BEETLES2膜增强LFA检测性能。 图片来源：Nature communications 使用BEETLES2膜增强临床检测 研究团队使用了临床样本，并纳入了临界病毒载量（26≤Ct<30）和低病毒载量（Ct≥30）的样本，商业LFA的检测灵敏度大幅下降。对于NP/OP样品，商业LFA的灵敏度为10%（3/30 = 10%)。使用BEETLES2灵敏度可提高到90%（27/30）。 与唾液样本商业LFA富集前的灵敏度相比（3/12 = 25%），所有使用BEETLES2测试的样本都具有更高的灵敏度（10/12 = 83.3%），表明样品富集后性能增强。无症状病例中，BEETLES2灵敏度也更高（3/4 = 75%），对比商业LFA（0/4 = 0%)。不仅如此，来自健康对照组的比色信号（n = 20） 显示100%的特异性（真阴性=20/20）（图f）。 结果说明，BEETLES2系统符合世界卫生组织（WHO）关于POCT的“理想标准”指南（敏感性：>90%，特异性：>99%，Ct≥30，检测时间：<20 min）。
BEETLES2膜增强临床检测。 图片来源：Nature communications 用于日常监控的样本应答平台 为了实现新冠肺炎日常监测的可行性，研究团队每天从有症状的感染者那里采集NP/OP和唾液样本（如下图）。所有患者在出现症状的第一天均为RT-qPCR阳性。每日监测数据显示，BEETLES2的LFA检测与病毒载量（Ct值）高度相关，使用BEETLES2，可以测量超过37的Ct值，而商业LFA无法检测到这一点。
BEETLES2用于日常监控的样本应答平台。 图片来源：Nature communications 总结与讨论 BEETLES2的样品富集具有强大的渗透选择性和可调谐性，3 min以内即可完成。它有两个显著的实际优势：首先，该系统可以很容易地与成熟的商业LFA相结合，并与商业LFA（分别为14.29%和41.94%）相比，提高其对包括德尔塔和奥密克戎变异株在内的低滴度临床样本的临床敏感性（>88%）和准确性（>91%）。其次，BEETLES2可以从鼻拭子、唾液和血清中选择性地富集SARS-CoV-2病毒、N蛋白和IgG，表明其对新冠肺炎抗原和IgG检测的通用性和适用性。将BEETLES2的样品富集与商业LFA相结合代表着POCT检测的进步，因为它符合世界卫生组织对POCT的所有要求，即易用性、低成本和准确性。 为了将BEETLES2商业化，应该解决以下问题：1）耐压设计。由于BEETLES2测定是在施加的压力下进行的，因此不能容忍液体样品泄漏。特别是在处理传染性样本时，为了安全起见，需要采用无泄漏设计。2） 血清学快速诊断测试中的样本量问题。对于血清学快速诊断测试，通常通过手指穿刺获得1-2滴（<100 µL）；因此需要开发小样本量的血液检测设备。与BEETLES2膜集成的微流体设备是血清学检测的理想候选者，3）保质期是将BEETLES2商业化的关键参数。研究团队在室温下获得了长达15天的稳定性。但是如需商业化，仍需要将延长BEETLES2室温保存稳定性。 |
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